محیط کشت BCYE آگار

محیط کشت BCYE آگار یا همان محیط کشت بافر عصاره مخمر زغال چوب، Feeley و همکارانش در سال 1978 محیطی را برای جداسازی گونه لژیونلا ایجاد کردند که بعداً با جایگزینی عصاره مخمر به جای کازئین هیدرولیز شده و عصاره گوشت گاو و جایگزینی نشاسته با زغال فعال اصلاح شد و نام آن را عصاره مخمر چوبی (CYE) آگار گذاشتند. اصلاح دیگری توسط Pasculle و همکاران در سال 1980 با افزودن بافر ACES یا (N-2-acetamido-2-aminoethane sulfonic acid) به منظور حفظ pH مناسب برای رشد بهینه تعیین شده انجام شد. محیط جدید به عنوان Buffered Charcoal Yeast Extract) BCYE) نامگذاری شد.

در سال 1981، Edelstein و همکاران، محیط را با افزودن نمک پتاسیم آلفا-کتوگلوتاریک اسید که حساسیت محیط را افزایش داد، اصلاح کردند. برای استفاده در کشت و جداسازی اولیه گونه های لژیونلا در آب و سایر نمونه های مشکوک به نگهداری باکتری توصیه می شود.

ترکیب محیط کشت BCYE آگار

pH نهایی (در 25 درجه سانتیگراد) 0.2±6.9

اصول BCYE Agar

گونه های لژیونلا میله های باریک و گرم منفی غیر اسپورساز هستند که باعث ذات الریه (بیماری لژیونر) یا تب پونتیاک می شوند. باکتری ها در محیط های معمولی کربوهیدرات ها را اکسید یا تخمیر نمی کنند یا در آگار خون گوسفند رشد نمی کنند. رشد در محیط BCYE آگار بسیار بهتر و سریعتر است.

محیط BCYE شامل اجزای مختلفی است که به جداسازی و رشد باکتری کمک می کند. اسیدهای آمینه منابع اصلی انرژی لژیونلا هستند. اسید آمینه L-cystine نیاز مطلق دارد زیرا نقش مهمی در متابولیسم رشد لژیونلا دارد.

اسید آمینه همراه با پیروفسفات آهن به رشد لژیونلا کمک می کند. این محیط حاوی زغال چوب است که به عنوان سم زدایی عمل می کند و زغال چوب فعال پراکسید هیدروژن را تجزیه می کند، یک محصول متابولیکی سمی برای گونه های لژیونلا، و همچنین ممکن است دی اکسید کربن را جمع آوری کند و کشش سطحی را اصلاح کند. عصاره مخمر به عنوان یک منبع غنی از ویتامین ها، نیتروژن و کربن لازم برای حمایت از رشد عمل می کند. بافر ACES اسیدیته بهینه را برای رشد حفظ می کند در حالی که L-cystine hydrochloride. پیروفسفات آهن و α-کتوگلوتارات رشد گونه های لژیونلا را با تحریک آنزیم های مهارکننده اکسیژن تحریک می کنند. آگار عامل انجماد است. در صورت لزوم می توان عوامل انتخابی را اضافه کرد.

تهیه محیط کشت BCYE آگار

1. 20 گرم را در 500 میلی لیتر آب مقطر معلق کنید. ( در محیط های کشت تجاری میزان محیط برای حل شدن بستگی به دستورالعمل شرکت سازنده دارد)
2. حرارت دهید تا به جوش آید تا محیط کاملا حل شود.
3. با اتوکلاو کردن با فشار 15 پوند (121 درجه سانتیگراد) به مدت 15 دقیقه استریل کنید و تا دمای 50 درجه سانتیگراد خنک کنید.
4. به صورت آسپتیک،محتویات هیدراته شده 1 ویال (10 میلی لیتر) مکمل رشد لژیونلا را اضافه کنید.
5. محیط ها را در صفحات پتری بریزید و بگذارید بماند تا جامد شود.

• نکته: محیط باید به طور مداوم مخلوط شود تا زمانی که ریخته شود تا ذرات زغال چوب معلق بماند.

تفسیر نتیجه در BCYE Agar

لژیونلا پنوموفیلا کلنی های کوچک تا بزرگ، صاف، بی رنگ تا کم رنگ، آبی مایل به خاکستری، کمی مخاطی ایجاد می کند که با افزایش سن سفیدتر و رشته ای تر می شوند و زیر نور فرابنفش موج بلند به رنگ زرد مایل به سبز فلورسانس می شوند.

سطح کلنی عموماً صاف با لبه‌های دقیق است، اما برخی از گونه‌ها ممکن است وقتی به صورت میکروسکوپی مشاهده می‌شوند، ظاهری شیشه‌ای یا تخم‌مرغ سرخ شده ایجاد کنند.

موارد استفاده از BCYE آگار

1. این محیط برای جداسازی و شناسایی احتمالی لژیونلا استفاده می شود.
2. این یک محیط پایه است که برای جداسازی لژیونلا از نمونه های بالینی و محیطی استفاده می شود.

محدودیت ها

1. توصیه می شود برای شناسایی کامل آزمایشات بیوشیمیایی، ایمونولوژیکی، مولکولی یا طیف سنجی جرمی روی کلنی های حاصل از کشت خالص انجام شود.
2. همچنین توصیه می شود از بیش از یک نوع محیط برای جداسازی گونه های لژیونلا استفاده شود و پلیت های غیر انتخابی و انتخابی BCYE آگار به صورت موازی تلقیح شوند.
3. به دلیل تنوع غذایی، برخی از سویه ها ممکن است با رشد ضعیفی مواجه شوند یا در این محیط رشد نکنند.
4. مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری (CDC) انکوباسیون نمونه های محیطی با 2.5٪ CO2 را توصیه می کند. با این حال، L. gormanii تنها گونه شناخته شده با رشد افزایش یافته تحت این شرایط است.
5. کلنی های لژیونلا که روی فیلترهای غشایی سفید ایجاد می شوند ممکن است ظاهر متفاوتی با آنهایی که در برابر فیلتر پس زمینه سیاه یا تیره ایجاد می شوند داشته باشند.
6. هنگام استفاده از گونه های لژیونلا، مهم است که از تشکیل آئروسل جلوگیری شود.

مطالب مفید: