محیط کشت شکلات آگار

محیط کشت شکلات آگار اساساً همان آگار خون است با این تفاوت که در حین آماده‌سازی گلبول‌های قرمز وقتی به پایه آگار مذاب اضافه می‌شوند لیز می‌شوند. در نتیجه، لیز سلولی مواد مغذی داخل سلولی مانند هموگلوبین، هیمین (فاکتور X) و کوآنزیم نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید (NAD یا فاکتور V) را در آگار آزاد می کند که توسط باکتری های سختگیر استفاده می شود. لیز گلبول قرمز زمانی که آماده‌می‌شود رنگ قهوه‌ای شکلاتی به محیط می دهد که نام آگار از آن گرفته‌شده است. شایع ترین پاتوژن های باکتریایی که برای رشد به محیط فوق الذکر نیاز دارند عبارتند از نایسریا گونوره و گونه های هموفیلوس.

ترکیبات محیط کشت شکلات آگار

pH نهایی 0.2 ± 7.2 (در دمای 25 درجه سانتیگراد)

اصول شکلات آگار

پایه آگار شکلاتی با افزودن مکمل ها باعث رشد عالی ارگانیسم های سختگیر بدون رشد بیش از حد توسط موجودات آلوده می شود. هضم کازئین و بافت حیوانی که ارگانیسم را با مواد مغذی نیتروژن دار، اسیدهای آمینه و سایر عناصر ضروری برای رشد ارگانیسم ها تامین می کند. از آنجایی که گونه‌های نایسریا به مواد سمی مانند اسیدهای چرب بسیار حساس هستند، افزودن نشاسته ذرت به خنثی کردن متابولیت های سمی احتمالی کمک می کند، در حالی که فسفات پتاسیم به حفظ pH یکنواخت در طول رشد کمک می کند. کلرید سدیم تعادل اسمزی را حفظ می کند و در نتیجه یکپارچگی سلول ها را حفظ می کند.

شکلات آگار نیز به عنوان یکی از انواع  خون آگار در نظر گرفته می شود که حاوی گلبول های قرمز خون است که با حرارت آهسته تا 80 درجه سانتی گراد لیز شده‌اند. گرما آنزیم هایی را غیرفعال می کند که در غیر این صورت می توانند NAD را تجزیه کنند. مکمل‌های اضافه شده فاکتور X (از هموگلوبین) و فاکتور V (از مکمل رشد) مورد نیاز ارگانیسم‌های سخت‌گیر را فراهم می‌کنند.

همچنین می توان برخی تغییرات را برای رشد ارگانیسم خاص انجام داد. Thayer-Martin Media یک آگار شکلاتی است که با ونکومایسین، نیستاتین و کولیستین برای مهار فلور طبیعی از جمله نایسریا غیر بیماریزا برای جداسازی انتخابی N. gonorrhoeae و N. meningitidis تکمیل شده‌است. آگار شکلات مکمل باسیتراسین یک محیط انتخابی است که برای بهبود جداسازی اولیه H. influenzae از نمونه‌های حاوی فلور مخلوط باکتری و/یا قارچ استفاده می‌شود. آگار شکلات مکمل با جفت باز GC و مکمل رشد اصلاح دیگری است که نیازهای رشد ویژه (hemin و NAD) مورد نیاز برای جداسازی ارگانیسم‌های سخت‌گیر مانند H. influenzae را هنگام انکوبه شدن در دمای 35-37 درجه سانتی‌گراد در اتمسفر CO2 5٪ پشتیبانی می‌کند.

تهیه محیط کشت شکلات آگار

• تهیه محلول هموگلوبین

هموگلوبین را به آب مقطر اضافه کنید و حجم را به 500 میلی لیتر برسانید. کاملاً مخلوط کنید و به مدت 15 دقیقه با فشار 15 پوند در دمای 21 درجه سانتیگراد در اتوکلاو قرار دهید. در دمای 45 تا 50 درجه سانتیگراد خنک کنید.

• آماده سازی محیط

اجزاء به جز محلول هموگلوبین را به آب مقطر اضافه کنید و حجم را به 500 میلی لیتر برسانید. کاملا مخلوط کنید. به آرامی حرارت دهید تا به جوش بیاید. اتوکلاو به مدت 15 دقیقه با فشار 15 پوند در دمای 21 درجه سانتیگراد. در دمای 45 تا 50 درجه سانتیگراد خنک کنید. 500 میلی لیتر محلول هموگلوبین استریل را اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید. در ظروف پتری استریل بریزید یا در لوله های استریل پخش کنید.

تفسیر نتیجه آگار شکلاتی

• Neisseria gonorrhoeae کلنی‌های مخاطی کوچک، خاکستری تا سفید، قوام صاف و حاشیه‌های مشخص تولید می‌کند.
• نایسریا مننژیتیدیس کلنی‌های بزرگ‌تر خاکستری مایل به آبی، مخاطی، گرد، محدب، صاف، مرطوب، درخشان با لبه‌های کاملاً مشخص تولید می‌کند.
• هموفیلوس آنفولانزا کلنی های کوچک، بی رنگ و مرطوب با بوی منی مشخص تولید می کند.

موارد استفاده از آگار شکلاتی

• از آن در جداسازی و پرورش میکروارگانیسم های سختگیر، به ویژه گونه های هموفیلوس و نایسریا استفاده می شود.
• برای جداسازی نایسریا گونوره از موارد مزمن و حاد عفونت های گنوکوکی استفاده می شود.

محدودیت های شکلات آگار

• توصیه می شود برای شناسایی کامل، آزمایشات بیوشیمیایی و یا سرولوژیک اضافی روی کلنی های جدا شده از کشت خالص انجام شود.
• شکلات آگار یک محیط غنی شده است، بنابراین موجودات غیر بیماری زا ممکن است باکتری های بیماری زا را بیش از حد رشد دهند. اگر جداسازی N. gonorrhoeae مورد نظر است، باید یک محیط انتخابی مانند Thayer Martin Agar به موازات این فرمول غیر انتخابی استفاده شود.
• هموگلوبین رسوبی ممکن است به صورت لکه های تیره روی یا در محیط ظاهر شود و بر عملکرد محیط تأثیری ندارد.
• وجود یا عدم وجود N. gonorrhoeae در یک نمونه وجود احتمالی سایر ارگانیسم های بیماری را رد نمی کند.

مطالب مفید: