محیط کشت باکتری منبعی از مواد مغذی برای حمایت از رشد میکروارگانیسم ها در شرایط آزمایشگاهی است. medium به رشد و شمارش سلول های میکروبی، انتخاب میکروارگانیسم ها و بقای میکروارگانیسم ها کمک می کند. محیط کشت می تواند مایع یا ژل باشد.

ترکیبات رایج محیط کشت باکتری

پپتون منبع کربن و نیتروژن است.
عصاره گوشت گاو منبع اسید آمینه، ویتامین ها، مواد معدنی است.
عصاره مخمر – منبع ویتامین، کربن، نیتروژن.
آب مقطر
آگار – عامل انجماد.

چگونه محیط های کشت را آماده کنیم؟

  1. مقدار پودر مواد را روی دستگاه توزین وزن کنید.
  2. مواد را در آب مقطر حل کنید.
  3. در صورت نیاز PH محیط را تنظیم کنید.
  4. آگار را اضافه کرده و جوشانده تا حل شود.
  5. محیط را داخل فلاسک بریزید.
  6. وقتی مواد کاملا حل شد، محیط را اتوکلاو کنید.
  7. استریل کردن در اتوکلاو برای جلوگیری از آلودگی، در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انجام می شود.
  8. پس از اتوکلاو فلاسک محیط را در جریان هوای آرام قرار دهید.
  9. جریان هوای آرام را با الکل 70 درصد استریل کنید.
  10. کمی محیط را خنک می کند و برای انجماد در صفحات پتری استریل می ریزد.
  11. سپس نمونه آماده پخش (پراکنده) / رگه است
  12. (حلقه تلقیح) روی محیط برای شناسایی یا جداسازی میکروب ها.
  13. صفحات پتری را با پارافین ببندید، آنها را برچسب بزنید.
  14. آنها را به مدت 24 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتیگراد معکوس نگه دارید.
  15. مشاهده کنید که نتیجه روز بعد تشکیل کلنی ها در رسانه ها قابل مشاهده است.

محیط معین شده (Defined medium) چیست؟

  • یک محیط تعریف شده دارای مقدار مشخصی از همه مواد است، مانند منبع کربن (گلوکز یا گلیسرول) و منبع نیتروژن (نمک آمونیوم یا نیترات به عنوان نیتروژن معدنی). محیط در آزمایشات رشد متابولیک، تغذیه ای و فیزیولوژیکی نیاز دارد. (Czapek Dox Medium)

محیط نامعین شده (Undefined medium) چیست؟

  • این محیط دارای ترکیبات پیچیده مختلفی در مقادیر نامشخص است، به عنوان مثال عصاره مخمر، گوشت گاو، نمک های مختلف و پروتئین آنزیمی. (سیب زمینی دکستروز آگار، مک کانکی آگار)

Complex media چیست؟

  • این محیط غیر از محیط پایه (basal media) است. موادی را اضافه کرده است تا ویژگی‌های میکروارگانیسم‌ها را با مواد مغذی منحصربه‌فرد به ارمغان بیاورد.
Types-of-culture-media

انواع محیط های کشت بر اساس قوام / حالت فیزیکی

1. Solid medium

2. محیط نیمه جامد

3. Liquid medium

1. محیط جامد

اصول محیط کشت جامد

  • این برای جداسازی باکتری ها به عنوان یک کشت خالص روی یک محیط جامد است.

رابرت کخ متوجه استفاده از محیط جامد شد.

آگار برای سخت شدن محیط در غلظت 1.5 تا 2.0 درصد استفاده می شود. محیط جامد امکان رشد باکتری ها را به صورت کلونی با رگه زدن روی محیط فراهم می کند. در دمای 37 درجه سانتیگراد جامد شد. آگار یک پلی ساکارید غیر شاخه ای است که از گونه های جلبک قرمز مانند Gelidium استخراج می شود. شناسایی کلنی ها در این محیط انجام می شود.

نمونه هایی از محیط جامد

رشد باکتری ها در Solid medium به صورت صاف، خشن، مخاطی، گرد، نامنظم، رشته ای، منقطع شکل ظاهر می شود.

2. Semi-solid medium

اصول محیط کشت نیمه جامد

این محیط تحرک باکتری ها و پرورش باکتری های میکروآئروفیل را نشان می دهد. این محیط دارای آگار با غلظت 0.5 درصد یا کمتر است. قوام ژله ای دارد.

نمونه هایی از محیط نیمه جامد

Stuart’s and Amies media, Hugh and Leifson’s oxidation fermentation medium, and Mannitol motility media

رشد باکتری ها در نیمه جامد به صورت یک خط ضخیم در محیط ظاهر می شود.

3. محیط مایع

اصول محیط مایع

این محیط رشد تعداد زیادی باکتری را نشان می دهد.

براث نامیده می شود که به باکتری ها اجازه می دهد تا با کدورت به طور یکنواخت رشد کنند. رشد در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور به مدت 24 ساعت رخ می دهد.محیط های مایع حاوی آگار نیستند. برای مطالعات تخمیر است.

نمونه هایی از محیط های مایع

رشد باکتری در محیط مایع – کدورت در انتهای براث مشاهده می شود.

انواع محیط های کشت بر اساس ترکیب شیمیایی/کاربرد

هفت محیط آزمایشگاهی معمول وجود دارد.

  • basal media
  • محیط کشت غنی شده
  • Selective media
  • محیط غنی سازی
  • محیط نشانگر یا محیط افتراقی
  • محیط انتقال
  • محیط نگهداری

1. محیط پایه (Basal media)

این محیط ساده است زیرا رشد بسیاری از میکروارگانیسم ها را افزایش می دهد. این یک محیط معمولی است که در آزمایشگاه استفاده می شود و کربن و نیتروژن دارد. این محیط کشت اجازه رشد باکتری را می دهد. باکتری های غیر سخت و بدون هیچ منبع غنی سازی؛ برای sub-culturing استفاده می‌شود. این یک محیط غیر انتخابی است.

استافیلوکوک و انتروباکتریاسه در این محیط رشد می کنند.

نمونه هایی از محیط های پایه
نوترینت آگار، پپتون واتر.

2. محیط غنی شده (Enriched media)

این محیط نیاز به افزودن مواد دیگری مانند خون، تخم مرغ یا سرم دارد. یک محیط غنی شده اجازه رشد میکروارگانیسم های ابداع شده را می دهد اما از رشد میکروب های دیگر و سختگیر جلوگیری می کند زیرا به مواد مغذی مانند ویتامین ها و مواد محرک رشد نیاز دارند.

نمونه ای از محیط های غنی شده

Blood agar, Chocolate agar, LSS, Monsor’s taurocholate, Lowenstein Jensen media. بلاد آگار باکتری های همولیتیک، محیط شکلاتی را برای N. gonorrhea شناسایی می کند.

3. محیط انتخابی (Selective media)

همانطور که از نام، می توان گفت، این محیط رشد انتخابی را نشان می دهد. میکروب ها یا میکروارگانیسم های مورد نظر رشد و از رشد میکروب های ناخواسته جلوگیری می کند. مهار با افزودن نمک های صفراوی، آنتی بیوتیک ها، رنگ ها، تنظیم PH رخ می دهد. محیط مبتنی بر آگار است. هر محیطی را می توان با افزودن آگار بازدارنده به انتخابی تبدیل کرد.

ردیفمحیطباکتری
1مانیتول آگار – دارای 7 درصد کلرید سدیم است که از رشد سایر میکروب ها جلوگیری می کند و باعث رشد استافیلوکوک می شود. دارای رنگ قرمز فنل است که اسید استافیلوکوکوس از مانیتول برای تولید اسید استفاده می کند و رنگ فنل قرمز از قرمز به زرد تغییر می کند.انتخابی برای استافیلوکوکوس اورئوس
2سالمونلا-شیگلا آگار
دی اکسی کولات آگار
برای جداسازی باکتری سالمونلا که باعث تیفوئید می شود استفاده می شود.
انتخابی برای شیگلا
3MacConkey Agar – دارای نمک های صفراوی است که از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری می کندجداسازی انتخابی برای انتروباکتریاسه
4TCBS آگار – محیط شفاف سبز روشن نمک صفراوی از رشد باکتری های ناخواسته جلوگیری می کندانتخابی برای Vibrio cholera.
V. cholera با تخمیر ساکارز اسید تولید می کند که به عنوان شاخصی به نام بروموتیمول آبی و کلونی زرد ظاهر می شود.
5Lowenstein Jensen Media- با افزودن مالاکیت سبز انتخابی می شود و رشد ناخواسته عوامل بیماری زا را متوقف می کند.انتخابی برای M. tuberculosis

4. محیط های غنی سازی (Enrichment media)

این یک محیط مایع است که همچنین اجازه رشد باکتری های مورد نظر را با چگالی کم می دهد. محیط شرایطی را به عنوان محیط انتخابی فراهم می کند و از رشد باکتری های ناخواسته جلوگیری می کند. برای جداسازی خاک و میکروارگانیسم های مدفوع است.

نمونه هایی از محیط های غنی سازی

Selenite F-broth جداسازی سالمونلا تیفی را از نمونه مدفوع انجام می دهد. سلنیوم اجازه رشد ارگانیسم های مورد نظر را می دهد و سطح تشخیص برای فلور روده افزایش می یابد.

5. محیط افتراقی (differential media)

این محیط تغییرات قابل مشاهده را به دلیل وجود نشانگر نشان می دهد. این باکتری ها را بر اساس رنگ کلنی که در همان صفحه رشد می کنند، متمایز می کند. ویژگی های بیوشیمیایی رشد ارگانیسم را با شاخص های شیمیایی مانند قرمز خنثی، قرمز فنل، آبی متیلن نشان می دهد.

نمونه هایی از محیط های افتراقی

مانیتول سالت آگار (تخمیر مانیتول کلنی های رنگ زرد را نشان می دهد). بلاد آگار برای افتراق بین همولیتیک و غیر همولیتیک استفاده می شود. MacConkey آگار به دلیل استفاده از لاکتوز کلنی های صورتی تولید می کند و غیر لاکتوز کلنی های رنگ پریده را نشان می دهد.

6. محیط انتقالی (Transport media)

این محیط نمونه ها را پس از جمع آوری برای کنترل رشد بیش از حد موجودات حمل می کنند. برای کشت، این محیط به عنوان انبار موقت عمل می کند. همچنین زنده ماندن عوامل بیماری زا را در نمونه حفظ کرده و از خشک شدن آنها جلوگیری می کند.

نمونه هایی از محیط های انتقالی

محیط انتقال Stuart’s ( فاقد کربن، نیتروژن، فاکتورهای رشد). محیط های انتقالی Cary Blair و VR برای انتقال نمونه مدفوع از بیماران وبا استفاده می شود. محیط Pikes به انتقال استرپتوکوک از بیماران گلو کمک می کند.

7. محیط نگهداری (Storage media)

ماندگاری کشت باکتری را حفظ می کند. نمونه ها عبارتند از:

  • cooked meat broth
  • NA egg saline
محیط کشت مایع

انواع محیط کشت باکتری بر اساس نیاز اکسیژن

میکروارگانیسم ها بسته به نیاز اکسیژن نیازهای متفاوتی برای رشد دارند.

1. محیط های هوازی

در این محیط، کشت میکروب ها آسان است، روی محیط جامد با نگهداری کشت در انکوباتور رشد صورت می گیرد. رشد را نشان می دهد.

نمونه هایی از محیط های هوازی عبارتند از: محیط مایع، محیط جامد

پپتون آب: 1٪ پپتون + 0.5٪ Nacl + 100 میلی لیتر آب.

نوترینت آگار: نوترینت براث + 2% آگار.

2. محیط های بی هوازی

محیط باکتری های بی هوازی را با اکسیژن کم کشت می دهد، پتانسیل اکسیداسیون-کاهش را کاهش می دهد. این محیط ها حاوی مواد مغذی اضافی مانند ویتامین K، هیمین و اکسیژن است که توسط یک فرآیند فیزیکی یا شیمیایی کاهش می یابد. افزودن گلوکز (1٪)، تیوگلیکولات (0.1٪)، اسید اسکوربیک (0.1٪)، سیستئین (0.05٪)، یا مواد پرکننده آهن اضافه شده تا باعث کاهش محیط شود. محیط در یک حمام آب جوشانده می شود تا اکسیژن محلول خارج شود و با پارافین استریل بسته بندی می شود.

نمونه هایی از Anaerobic environments

جداسازی RCM (Robertson cooked meat) برای کلستریدیوم sp.

براث تیوگلیکولات – دارای گلیکولات سدیم است که اکسیژن کم را حفظ می کند.

انواع محیط کشت با هدف خاص

1. محیط سنجش

محیط ها ویتامین ها، اسیدهای آمینه و آنتی بیوتیک ها را ارزیابی می کنند. مثال- تست حساسیت آنتی بیوتیکی محیط مورد استفاده مولر-هینتون آگار دارای 1.7% آگار برای انتشار بهتر آنتی بیوتیک ها می باشد. همچنین حاوی نشاسته است که سموم آزاد شده توسط باکتری ها را جذب می کند. در این صفحه منطقه مهار در اطراف آنتی بیوتیک ها دیده می شود.

2. محیط حداقل

محیط حداقل یک محیط تعریف شده با ترکیبات مختلف بسته به میکروارگانیسم های کشت شده است. حاوی منبع کربن مانند شکر/سوکسینات و نمک های معدنی مانند منیزیم، نیتروژن، گوگرد، فسفر است. کربن منبع انرژی است. نمک های منیزیم و آمونیوم منابع یونی برای تحریک متابولیسم هستند. فسفات یک عامل بافر است.

3. محیط تخمیر

این محیط برای میکروارگانیسم های بهینه است. محیط های تخمیر بازده بالایی از محصول را تولید می کنند. محیطها انرژی و مواد مغذی را برای رشد فراهم می کنند و محیط بستری را برای سنتز محصولات در تخمیر فراهم می کند.

Fermentation medium شامل اجزای اصلی و فرعی است :

اجزای اصلی – کربن و نیتروژن برای انرژی.

اجزای جزئی – حاوی نمک های معدنی، فاکتورهای رشد، ویتامین ها، بافر، عوامل ضد کف، اکسیژن محلول، گازها، بازدارنده های رشد، آنزیم ها است.

مواد مغذی در محیط های تخمیر به ارگانیسم و نوع فرآیند تخمیر بستگی دارد.

محیط رشد

مواد مغذی کمی دارد و مواد خام برای تخمیر بیشتر ایجاد می کند.

محیط تخمیر

دارای مواد مغذی بالایی است و محصولات نهایی را ایجاد می کند.

مثال: مخمر به 1% کربن نیاز دارد، اما تخمیر الکل به 12-13% کربن در محیط نیاز دارد.

کاربرد محیط کشت

  • برای کشت میکروب ها
  • برای شناسایی علت عفونت.
  • شناسایی ویژگی های میکروارگانیسم ها
  • برای جداسازی کشت خالص
  • برای نگهداری کشت استوک
  • برای مشاهده واکنش های بیوشیمیایی
  • برای آزمایش آلودگی میکروبی در هر نمونه.
  • برای بررسی اثر عوامل ضد میکروبی و نگهدارنده.
  • برای مشاهده نوع کلونی میکروب، رنگ، شکل، علت آن.
  • برای تمایز بین کلنی های مختلف.
  • برای ایجاد آنتی ژن برای استفاده در آزمایشگاه.
  • برای تخمین تعداد قابل دوام
  • برای تست حساسیت آنتی بیوتیکی

محدودیت های محیط کشت

  • خطر آلودگی متقابل.
  • مهارت بالا برای نتایج مطلوب لازم است.
  • افزایش خشک شدن محیط ممکن است رخ دهد.

مطالب مفید:

کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.