محیط کشت بلاد آگار

محیط کشت بلاد آگار یک محیط غنی‌شده با مواد مغذی متعدد است که عموماً به عنوان یک محیط پایه برای تهیه خون آگار با مکمل سازی با خون عرضه می شود.

Blood Agar به عنوان یک محیط پایه است که می تواند به عنوان یک محیط رشد عمومی استفاده‌شود. محیط پایه می تواند کلمبیا آگار یا تریپتیک سویا آگار هم باشد. آگار خون یک محیط عالی برای کشت باکتری های سختگیر است که به مواد مغذی خاصی نیاز دارند و در محیط های عمومی مانند نوترینت آگار به وفور رشد نمی کنند. حدود 5 درصد از خون پستانداران بدون فیبرینه (انسان، گوسفند یا اسب) به محیط پایه اتوکلاو شده اضافه می شود تا محیط بلاد آگار آماده‌شود. این یک محیط غنی‌شده است که از رشد باکتری های سختگیر حمایت می کند و از رشد برخی از باکتری ها مانند نایسریا و هموفیلوس جلوگیری می کند.

برای رشد این باکتری ها، مهارکننده‌های موجود در خون باید توسط بلاد آگار گرم‌شده غیرفعال شوند. بلاد آگار گرم‌شده به شکلات آگار تبدیل می شود که نایسریا و هموفیلوس را پشتیبانی می کند.
یکی از کاربردهای ضروری محیط کشت بلاد آگار مشاهده همولیز ناشی از باکتری در حال رشد است که می توان از آن برای شناسایی ارگانیسم استفاده کرد.
محیط کشت بلاد آگار بیشتر برای پرورش ارگانیسم های بیماری زا که قادر به تولید آنزیم های خارج سلولی هستند که باعث همولیز خون می شوند استفاده می شود.

ترکیبات محیط کشت بلاد آگار

آگار خون، مانند سایر محیط‌های تغذیه‌ای، دارای یک یا چند منبع پروتئین، نمک و عصاره گوشت گاو برای ویتامین ها و مواد معدنی است. علاوه بر این اجزا، 5 درصد خون پستانداران دفیبرینه شده نیز به محیط اضافه می‌شود. محیط کشت خون آگار به صورت تجاری و یا در صورت وجود مواد لازم در آزمایشگاه نیز قابل تهیه است. ترکیب دقیق پایه خون آگار در زیر آورده شده است:

شماره	اجزا	گرم/لیتر
1	پپتون	10
2	تریپتوز	10
3	سدیم کلراید	5
4	آگار	15

pH نهایی در 25 درجه سانتی گراد: 0.2 ± 7.3

به محیط پایه، 5% خون استریل پستانداران پس از اتوکلاو و قبل از ریختن روی پلیت ها اضافه می شود.

اصول محیط کشت بلاد آگار

آگار خون یک محیط مغذی غنی‌شده است که از رشد ارگانیسم های سختگیر با مکمل کردن آن با خون یا به عنوان یک محیط عمومی بدون خون حمایت می کند.

خون اضافه شده به پایه، با فراهم کردن فاکتورهای رشد اضافی مورد نیاز برای این موجودات سخت، تغذیه بیشتری را برای محیط فراهم می کند.

خون همچنین به دیدن واکنش های همولیتیک باکتری های مختلف کمک می کند. با این حال، واکنش‌های همولیتیک به نوع خون حیوان مورد‌استفاده بستگی دارد.

خون گوسفند بیشتر برای استرپتوکوک های گروه A استفاده می شود زیرا بهترین نتایج را ارائه می دهد، اما از رشد هموفیلوس همولیتیکوس حمایت نمی کند. به این دلیل است که خون گوسفند دارای کمبود نوکلئوتید پیریدین است.

رشد و همولیز H. haemolyticus با خون اسب بهتر است، و الگوی همولیز حتی ممکن است شبیه استرپتوکوک پیوژنز در خون گوسفند باشد.

علاوه‌بر خون مورد‌استفاده در محیط، پپتون و تریپتوز کربن، نیتروژن، اسیدهای آمینه، ویتامین ها و مواد معدنی مورد نیاز باکتری را تامین می کنند. پپتون و تریپتوز محلول در آب هستند که جذب مواد مغذی را برای ارگانیسم آسان تر می کند.

برای حفظ تعادل اسمزی محیط و جلوگیری از تغییر pH محیط در طول رشد، کلرید سدیم به محیط اضافه می شود.

آب مقطر محیطی را برای حل کردن مواد مغذی فراهم می کند تا باکتری ها راحت تر آنها را جذب کنند.

آگار عامل جامد کننده‌ای است که سطح پایداری را برای رشد ارگانیسم فراهم می کند که امکان مشاهده مورفولوژی کلنی و شمارش ارگانیسم را فراهم می کند.

در برخی موارد، فنل فتالئین فسفات برای تشخیص استافیلوکوک های مولد فسفات، همراه با نمک و آگار برای ارزیابی آلودگی سطح به محیط اضافه می شود.

آگار خون و همولیز

همولیز عبارت است از لیز گلبول های قرمز در خون به دلیل آنزیم های خارج سلولی تولید‌شده توسط گونه‌های باکتریایی خاص. آنزیم های خارج سلولی تولید شده توسط این باکتری ها همولیزین نامیده می شوند که به صورت شعاعی از کلنی ها به بیرون منتشر می شوند و باعث لیز کامل یا جزئی گلبول های قرمز می شوند. چهار نوع مختلف همولیز بر روی آگار خون مشاهده می شود که هر کدام با ناحیه‌ای از همولیز موجود در اطراف کلنی‌های در حال رشد قابل شناسایی هستند.

1. همولیز آلفا

همولیز آلفا با تغییر رنگ سبز مایل به خاکستری یا قهوه‌ای در اطراف کلنی در نتیجه لیز نسبی گلبول های قرمز تعریف می شود.
در طی آلفا همولیز، H2O2 تولید‌شده توسط باکتری باعث می شود هموگلوبین موجود در RBC محیط به متهموگلوبین تبدیل شود.
برخی از گونه‌های α-همولیتیک بخشی از فلور طبیعی انسان هستند، اما برخی از گونه‌ها مانند استرپتوکوک پنومونیا باعث ذات الریه و سایر عفونت های شدید می شوند.

2. بتا همولیز

بتا همولیز با یک ناحیه شفاف همولیز در زیر و اطراف کلنی ها زمانی‌که در آگار خون رشد می کند تعریف می شود.
ناحیه شفاف در‌نتیجه لیز کامل گلبول های قرمز موجود در محیط ظاهر می شود و باعث دناتوره شدن هموگلوبین و تشکیل محصولات بی رنگ می شود.
باکتری های بتا همولیتیک شامل استرپتوکوک های گروه A مانند S. pyogenes و استرپتوکوک های گروه B مانند S. agalactiae هستند که هر دو با عفونت های شدید در انسان مرتبط هستند.

3. گاما همولیز

گاما همولیز غیر همولیز نیز نامیده می شود زیرا هیچ لیز گلبول های قرمز اتفاق نمی افتد.
در‌نتیجه تغییر رنگ یا ناحیه همولیز در زیر یا اطراف کلنی ها مشاهده نمی شود.
گونه‌هایی مانند نایسریا مننژیدیت غیر همولیتیک یا گاما همولیتیک هستند.

4. Alpha prime or wide zone alpha hemolysis

همولیز آلفا اول توسط یک ناحیه کوچک از گلبول های قرمز دست‌نخورده در مجاورت کلنی باکتری تعریف می شود، با منطقه‌ای از لیز کامل گلبول های قرمز که ناحیه گلبول های قرمز دست‌نخورده را احاطه کرده‌است.
این ممکن است با بتا همولیز اشتباه گرفته‌شود، زیرا یک منطقه شفاف در اطراف کلنی ها ظاهر می شود.

آماده‌سازی محیط کشت بلاد آگار

حدود 40 گرم از محیط آماده‌شده به 1000 میلی لیتر آب مقطر یا دیونیزه اضافه می شود.
سوسپانسیون تا زمان جوشیدن گرم می شود تا محیط کاملاً حل شود.
سپس با اتوکلاو کردن آن در فشار 15 پوند و 121 درجه سانتیگراد به مدت حدود 15 دقیقه استریل می شود.
سپس محیط را از اتوکلاو خارج‌کرده و تا حدود 40-45 درجه سانتیگراد خنک می کنیم.
به این، خون 5 درصد V/V استریل دفیبرینه‌شده به صورت آسپتیک اضافه‌شده و به‌خوبی مخلوط می شود.
سپس محیط را در صفحات پتری استریل تحت شرایط استریل ریخته می شود.

نگهداری محیط کشت بلاد آگار

محیط به شکل پودر باید بین 10 تا 30 درجه سانتیگراد در ظرف دربسته نگهداری شود.
محیط آماده‌شده باید در دمای 30-20 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
ظرف حاوی محیط باید در یک منطقه تهویه‌خشک و محافظت‌شده از دمای شدید و منابع اشتعال نگهداری شود.
محصول باید قبل از تاریخ انقضای روی برچسب استفاده شود.
پس از باز کردن درب محصول باید درب محصول را محکم ببندید و به طور مناسب نگهداری شود.
محصول در محیط مرطوب نباشد چرا که رطوبت را نسبتاً سریع جذب می کند.

تفسیر نتیجه بر روی آگار خون

محیط پایه به رنگ کهربایی روشن است که ممکن است ژل شفاف تا کمی شیری رنگ به نظر برسد. پس از افزودن 5٪، V/V خون استریل دفیبرینه‌شده، با این حال؛ ژل مات قرمز رنگ روی صفحات پتری تشکیل می شود. جدول زیر رشد باکتری‌های مهم پزشکی را با مورفولوژی کلونی آنها در محیط کشت آگار خون نشان می دهد:

شماره	ارگانیسم	رشد	مورفولوژی کلنی	همولیز
1	نایسریا مننژیتیس	رشد انبوه	کلنی های خاکستری و بدون رنگدانه که گرد، صاف، مرطوب، درخشان و محدب به نظر می رسند، با لبه های مشخص.	غیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
2	سالمونلا تیفی	رشد انبوه	کلنی های بی رنگ صاف، مرطوب و مسطح با محدوده قطر 2-4 میلی متر.	غیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
3	استافیلوکوکوس اورئوس	رشد خوب	کلنی های دایره ای، محدب و صاف به رنگ زرد طلایی با قطر 2-4 میلی متر؛ کلنی های مات با ناحیه همولیز.	بتا همولیتیک
4	استافیلوکوکوس اپیدرمیس	رشد خوب	دایره ای، کلنی های به قطر 1-4 میلی متر؛ خاکستری تا سفید با ارتفاع محدب کم. کلنی های مرطوب و درخشان	غیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
5	استرپتوکوکوس پیوژنز	رشد خوب	کلنی های سفید مایل به خاکستری با قطر بیش از 0.5 میلی متر؛ کلنی ها توسط ناحیه ای از بتا همولیز احاطه شده اند که اغلب دو تا چهار برابر قطر کلنی است.	بتا همولیتیک
6	استرپتوکوکوس پنومونیه	رشد خوب	کوچک، خاکستری، مرطوب (گاهی اوقات مخاطی در سویه های بدخیم محصور شده)، کلنی ها با منطقه مشخصه آلفا همولیز (سبز)؛ به دلیل اتولیز، اغلب یک ناحیه همولیز گودی مانند نسبت به ظاهر معمولی دهانه مانند ایجاد می کند.	آلفا همولیتیک
7	سودوموناس آئروژینوزا	رشد انبوه	کلنی های بزرگ به قطر 2-5 میلی متر؛ کلنی های مسطح که خاکستری تا سفید رنگ با حاشیه موج دار با ناحیه بتا همولیز هستند.	بتا همولیتیک

کاربرد بلاد آگار

هدف اولیه بلاد آگار کشت و جداسازی ارگانیسم های سختگیر مانند نایسریا و استرپتوکوک است.
همچنین می توان از آن برای تمایز نوع همولیز مبتنی بر باکتری (α-، β- یا γ-همولیتیک) که روی آگار تولید می کنند استفاده کرد.
از بلاد آگار می توان برای تشخیص استافیلوکوک های مولد فسفات با افزودن فنل فتالئین فسفات به محیط استفاده کرد.
آگار خون اغلب برای تهیه آنتی‌ژن های سالمونلا تیفی استفاده می شود.
بنیان خون آگار یک روش استاندارد برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های غذا در‌نظر گرفته‌می‌شود.

محدودیت های محیط کشت بلاد آگار

رشد هموفیلوس همولیتیکوس در بلاد آگار به دلیل وجود مهارکننده‌های مختلف مهار می‌شود که فقط با گرم کردن محیط پس از افزودن خون غیرفعال می‌شوند.
الگوی همولیز ممکن است با نوع خون مورد استفاده متفاوت باشد.
افزودن خون خرگوش یا اسب به محیط پایه از رشد H. hemolyticus حمایت می کند، اما رشد آن شبیه گونه‌های استرپتوکوک است و بنابراین باید تایید شود.

مطالب مفید:

درحال حاضر مجموعه کیمیا زیست گستر نوین قادر به ارائه انواع مواد‌اولیه با گریدهای غذایی، دارویی، آرایشی، بهداشتی و صنعتی در حجم های بالا و کیفیت عالی از تولید‌کننده‌های معتبر می باشد. درصورت نیاز می توانید درخواست خود را با ما درمیان گذاشته تا در سریعترین زمان ممکن اطلاعات لازم را در اختیارتان قرار دهیم.