محیط کشت بلاد آگار

محیط کشت بلاد آگار یک محیط غنی شده با مواد مغذی متعدد است که عموماً به عنوان یک محیط پایه برای تهیه خون آگار با مکمل سازی با خون عرضه می شود.

Blood Agar به عنوان یک محیط پایه است که می تواند به عنوان یک محیط رشد عمومی استفاده شود. محیط پایه می تواند کلمبیا آگار یا تریپتیک سویا آگار هم باشد. آگار خون یک محیط عالی برای کشت باکتری های سختگیر است که به مواد مغذی خاصی نیاز دارند و در محیط های عمومی مانند نوترینت آگار به وفور رشد نمی کنند. حدود 5 درصد از خون پستانداران بدون فیبرینه (انسان، گوسفند یا اسب) به محیط پایه اتوکلاو شده اضافه می شود تا محیط بلاد آگار آماده شود. این یک محیط غنی شده است که از رشد باکتری های سختگیر حمایت می کند و از رشد برخی از باکتری ها مانند نایسریا و هموفیلوس جلوگیری می کند.

  • برای رشد این باکتری ها، مهارکننده های موجود در خون باید توسط بلاد آگار گرم شده غیرفعال شوند. بلاد آگار گرم شده به شکلات آگار تبدیل می شود که نایسریا و هموفیلوس را پشتیبانی می کند.
  • یکی از کاربردهای ضروری محیط کشت بلاد آگار مشاهده همولیز ناشی از باکتری در حال رشد است که می توان از آن برای شناسایی ارگانیسم استفاده کرد.
  • محیط کشت بلاد آگار بیشتر برای پرورش ارگانیسم های بیماری زا که قادر به تولید آنزیم های خارج سلولی هستند که باعث همولیز خون می شوند استفاده می شود.
محیط کشت بلاد آگار

ترکیبات محیط کشت بلاد آگار

آگار خون، مانند سایر محیط های تغذیه ای، دارای یک یا چند منبع پروتئین، نمک و عصاره گوشت گاو برای ویتامین ها و مواد معدنی است. علاوه بر این اجزا، 5 درصد خون پستانداران دفیبرینه شده نیز به محیط اضافه می شود. محیط کشت خون آگار به صورت تجاری و یا در صورت وجود مواد لازم در آزمایشگاه نیز قابل تهیه است. ترکیب دقیق پایه خون آگار در زیر آورده شده است:

شمارهاجزاگرم/لیتر
1پپتون10
2تریپتوز10
3سدیم کلراید5
4آگار15

pH نهایی در 25 درجه سانتی گراد: 0.2 ± 7.3

  • به محیط پایه، 5% خون استریل پستانداران پس از اتوکلاو و قبل از ریختن روی پلیت ها اضافه می شود.

اصول محیط کشت بلاد آگار

آگار خون یک محیط مغذی غنی شده است که از رشد ارگانیسم های سختگیر با مکمل کردن آن با خون یا به عنوان یک محیط عمومی بدون خون حمایت می کند.

خون اضافه شده به پایه، با فراهم کردن فاکتورهای رشد اضافی مورد نیاز برای این موجودات سخت، تغذیه بیشتری را برای محیط فراهم می کند.

خون همچنین به دیدن واکنش های همولیتیک باکتری های مختلف کمک می کند. با این حال، واکنش‌های همولیتیک به نوع خون حیوان مورد استفاده بستگی دارد.

خون گوسفند بیشتر برای استرپتوکوک های گروه A استفاده می شود زیرا بهترین نتایج را ارائه می دهد، اما از رشد هموفیلوس همولیتیکوس حمایت نمی کند. به این دلیل است که خون گوسفند دارای کمبود نوکلئوتید پیریدین است.

رشد و همولیز H. haemolyticus با خون اسب بهتر است، و الگوی همولیز حتی ممکن است شبیه استرپتوکوک پیوژنز در خون گوسفند باشد.

علاوه بر خون مورد استفاده در محیط، پپتون و تریپتوز کربن، نیتروژن، اسیدهای آمینه، ویتامین ها و مواد معدنی مورد نیاز باکتری را تامین می کنند. پپتون و تریپتوز محلول در آب هستند که جذب مواد مغذی را برای ارگانیسم آسان تر می کند.

برای حفظ تعادل اسمزی محیط و جلوگیری از تغییر pH محیط در طول رشد، کلرید سدیم به محیط اضافه می شود.

آب مقطر محیطی را برای حل کردن مواد مغذی فراهم می کند تا باکتری ها راحت تر آنها را جذب کنند.

آگار عامل جامد کننده ای است که سطح پایداری را برای رشد ارگانیسم فراهم می کند که امکان مشاهده مورفولوژی کلنی و شمارش ارگانیسم را فراهم می کند.

در برخی موارد، فنل فتالئین فسفات برای تشخیص استافیلوکوک های مولد فسفات، همراه با نمک و آگار برای ارزیابی آلودگی سطح به محیط اضافه می شود.

آگار خون و همولیز

همولیز عبارت است از لیز گلبول های قرمز در خون به دلیل آنزیم های خارج سلولی تولید شده توسط گونه های باکتریایی خاص. آنزیم های خارج سلولی تولید شده توسط این باکتری ها همولیزین نامیده می شوند که به صورت شعاعی از کلنی ها به بیرون منتشر می شوند و باعث لیز کامل یا جزئی گلبول های قرمز می شوند. چهار نوع مختلف همولیز بر روی آگار خون مشاهده می شود که هر کدام با ناحیه ای از همولیز موجود در اطراف کلنی های در حال رشد قابل شناسایی هستند.

1. همولیز آلفا

  • همولیز آلفا با تغییر رنگ سبز مایل به خاکستری یا قهوه ای در اطراف کلنی در نتیجه لیز نسبی گلبول های قرمز تعریف می شود.
  • در طی آلفا همولیز، H2O2 تولید شده توسط باکتری باعث می شود هموگلوبین موجود در RBC محیط به متهموگلوبین تبدیل شود.
  • برخی از گونه های α-همولیتیک بخشی از فلور طبیعی انسان هستند، اما برخی از گونه ها مانند استرپتوکوک پنومونیا باعث ذات الریه و سایر عفونت های شدید می شوند.

2. بتا همولیز

  • بتا همولیز با یک ناحیه شفاف همولیز در زیر و اطراف کلنی ها زمانی که در آگار خون رشد می کند تعریف می شود.
  • ناحیه شفاف در نتیجه لیز کامل گلبول های قرمز موجود در محیط ظاهر می شود و باعث دناتوره شدن هموگلوبین و تشکیل محصولات بی رنگ می شود.
  • باکتری های بتا همولیتیک شامل استرپتوکوک های گروه A مانند S. pyogenes و استرپتوکوک های گروه B مانند S. agalactiae هستند که هر دو با عفونت های شدید در انسان مرتبط هستند.

3. گاما همولیز

  • گاما همولیز غیر همولیز نیز نامیده می شود زیرا هیچ لیز گلبول های قرمز اتفاق نمی افتد.
  • در نتیجه تغییر رنگ یا ناحیه همولیز در زیر یا اطراف کلنی ها مشاهده نمی شود.
  • گونه هایی مانند نایسریا مننژیدیت غیر همولیتیک یا گاما همولیتیک هستند.

4. Alpha prime or wide zone alpha hemolysis

  • همولیز آلفا اول توسط یک ناحیه کوچک از گلبول های قرمز دست نخورده در مجاورت کلنی باکتری تعریف می شود، با منطقه ای از لیز کامل گلبول های قرمز که ناحیه گلبول های قرمز دست نخورده را احاطه کرده است.
  • این ممکن است با بتا همولیز اشتباه گرفته شود، زیرا یک منطقه شفاف در اطراف کلنی ها ظاهر می شود.

آماده سازی محیط کشت بلاد آگار

  1. حدود 40 گرم از محیط آماده شده به 1000 میلی لیتر آب مقطر یا دیونیزه اضافه می شود.
  2. سوسپانسیون تا زمان جوشیدن گرم می شود تا محیط کاملاً حل شود.
  3. سپس با اتوکلاو کردن آن در فشار 15 پوند و 121 درجه سانتیگراد به مدت حدود 15 دقیقه استریل می شود.
  4. سپس محیط را از اتوکلاو خارج کرده و تا حدود 40-45 درجه سانتیگراد خنک می کنیم.
  5. به این، خون 5 درصد V/V استریل دفیبرینه شده به صورت آسپتیک اضافه شده و به خوبی مخلوط می شود.
  6. سپس محیط را در صفحات پتری استریل تحت شرایط استریل ریخته می شود.

نگهداری محیط کشت بلاد آگار

  • محیط به شکل پودر باید بین 10 تا 30 درجه سانتیگراد در ظرف دربسته نگهداری شود.
  • محیط آماده شده باید در دمای 30-20 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
  • ظرف حاوی محیط باید در یک منطقه تهویه خشک و محافظت شده از دمای شدید و منابع اشتعال نگهداری شود.
  • محصول باید قبل از تاریخ انقضای روی برچسب استفاده شود.
  • پس از باز کردن درب محصول باید درب محصول را محکم ببندید و به طور مناسب نگهداری شود.
  • محصول در محیط مرطوب نباشد چرا که رطوبت را نسبتاً سریع جذب می کند.

تفسیر نتیجه بر روی آگار خون

محیط پایه به رنگ کهربایی روشن است که ممکن است ژل شفاف تا کمی شیری رنگ به نظر برسد. پس از افزودن 5٪، V/V خون استریل دفیبرینه شده، با این حال؛ ژل مات قرمز رنگ روی صفحات پتری تشکیل می شود. جدول زیر رشد باکتری های مهم پزشکی را با مورفولوژی کلونی آنها در محیط کشت آگار خون نشان می دهد:

محیط کشت بلاد آگار
شمارهارگانیسمرشدمورفولوژی کلنیهمولیز
1نایسریا مننژیتیسرشد انبوهکلنی های خاکستری و بدون رنگدانه که گرد، صاف، مرطوب، درخشان و محدب به نظر می رسند، با لبه های مشخص.غیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
2سالمونلا تیفیرشد انبوهکلنی های بی رنگ صاف، مرطوب و مسطح با محدوده قطر 2-4 میلی متر.غیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
3استافیلوکوکوس اورئوسرشد خوبکلنی های دایره ای، محدب و صاف به رنگ زرد طلایی با قطر 2-4 میلی متر؛ کلنی های مات با ناحیه همولیز.بتا همولیتیک
4استافیلوکوکوس اپیدرمیسرشد خوبدایره ای، کلنی های به قطر 1-4 میلی متر؛ خاکستری تا سفید با ارتفاع محدب کم. کلنی های مرطوب و درخشانغیر همولیتیک یا γ-همولیتیک.
5استرپتوکوکوس پیوژنزرشد خوبکلنی های سفید مایل به خاکستری با قطر بیش از 0.5 میلی متر؛ کلنی ها توسط ناحیه ای از بتا همولیز احاطه شده اند که اغلب دو تا چهار برابر قطر کلنی است.بتا همولیتیک
6استرپتوکوکوس پنومونیهرشد خوبکوچک، خاکستری، مرطوب (گاهی اوقات مخاطی در سویه های بدخیم محصور شده)، کلنی ها با منطقه مشخصه آلفا همولیز (سبز)؛ به دلیل اتولیز، اغلب یک ناحیه همولیز گودی مانند نسبت به ظاهر معمولی دهانه مانند ایجاد می کند.آلفا همولیتیک
7سودوموناس آئروژینوزارشد انبوهکلنی های بزرگ به قطر 2-5 میلی متر؛ کلنی های مسطح که خاکستری تا سفید رنگ با حاشیه موج دار با ناحیه بتا همولیز هستند.بتا همولیتیک

کاربرد بلاد آگار

  • هدف اولیه بلاد آگار کشت و جداسازی ارگانیسم های سختگیر مانند نایسریا و استرپتوکوک است.
  • همچنین می توان از آن برای تمایز نوع همولیز مبتنی بر باکتری (α-، β- یا γ-همولیتیک) که روی آگار تولید می کنند استفاده کرد.
  • از بلاد آگار می توان برای تشخیص استافیلوکوک های مولد فسفات با افزودن فنل فتالئین فسفات به محیط استفاده کرد.
  • آگار خون اغلب برای تهیه آنتی ژن های سالمونلا تیفی استفاده می شود.
  • بنیان خون آگار یک روش استاندارد برای تجزیه و تحلیل نمونه های غذا در نظر گرفته می شود.

محدودیت های محیط کشت بلاد آگار

  • رشد هموفیلوس همولیتیکوس در بلاد آگار به دلیل وجود مهارکننده‌های مختلف مهار می‌شود که فقط با گرم کردن محیط پس از افزودن خون غیرفعال می‌شوند.
  • الگوی همولیز ممکن است با نوع خون مورد استفاده متفاوت باشد.
  • افزودن خون خرگوش یا اسب به محیط پایه از رشد H. hemolyticus حمایت می کند، اما رشد آن شبیه گونه های استرپتوکوک است و بنابراین باید تایید شود.

مطالب مفید:

درحال حاضر مجموعه کیمیا زیست گستر نوین قادر به ارائه انواع مواد اولیه با گریدهای غذایی، دارویی، آرایشی، بهداشتی و صنعتی در حجم های بالا و کیفیت عالی از تولید کننده های معتبر می باشد. درصورت نیاز می توانید درخواست خود را با ما درمیان گذاشته تا در سریعترین زمان ممکن اطلاعات لازم را در اختیارتان قرار دهیم.