کشت ویروس

ویروس ها انگل های داخل سلولی اجباری هستند بنابراین برای بقای خود به میزبان وابسته هستند. آنها را نمی توان در محیط های کشت غیر زنده یا در محیط های حاوی آگار به تنهایی رشد داد. آنها به سلول های زنده برای پشتیبانی از تکثیر و رشد خود نیاز دارند.

هدف اصلی کشت ویروس عبارت است از:

1. جداسازی و شناسایی ویروس ها در نمونه های بالینی.
2. انجام تحقیق در مورد ساختار ویروسی، تکثیر، ژنتیک و اثرات روی سلول میزبان.
3. آماده سازی ویروس ها برای تولید واکسن

کشت ویروس ها را می توان تحت عناوین زیر مورد بحث قرار داد:

• تلقیح حیوانات
• تلقیح به جنین
• کشت سلولی

تلقیح حیوانات

• ویروس‌هایی که در تخم‌های جنینی و در کشت بافت کشت نمی‌شوند در آزمایشگاه حیوانات مانند موش، خوکچه هندی، همستر، خرگوش و پستانداران استفاده می‌شود.
• حیوانات انتخاب شده باید سالم و عاری از هرگونه بیماری واگیر باشند.
• موش های شیرخوار (کمتر از 48 ساعت سن) بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند.
• موش‌های شیرخوار به ویروس‌های توگاویروس و کوکساکی حساس هستند که از راه داخل مغزی و داخل بینی تلقیح می‌شوند.
• ویروس ها را می توان از طریق داخل صفاقی و زیر جلدی نیز تلقیح کرد.
• پس از تلقیح، ویروس در میزبان تکثیر می شود و بیماری ایجاد می کند. حیوانات برای علائم بیماری و مرگ مشاهده می شوند.
• سپس ویروس از بافت این حیوانات جدا و خالص می شود.
• تلقیح زنده برای اولین بار بر روی داوطلبان انسانی برای مطالعه ویروس تب زرد استفاده شد.

مزایای تلقیح حیوانات

1. تشخیص، پاتوژنز و علائم بالینی.
2. تولید آنتی بادی قابل شناسایی.
3. جداسازی اولیه ویروس های خاص
4. موش ها مدل قابل اعتمادی برای مطالعه تکثیر ویروس ارائه می دهند.
5. برای مطالعه پاسخ های ایمنی، اپیدمیولوژی و انکوژنز استفاده می شود.

معایب تلقیح حیوانات

1. گرانی و مشکلات نگهداری از حیوانات.
2. مشکل در انتخاب حیوانات برای ویروس خاص.
3. برخی از ویروس های انسانی را نمی توان در حیوانات رشد داد، یا می توان آنها را رشد داد اما باعث بیماری نمی شود.
4. موش ها مدل هایی برای تولید واکسن ارائه نمی دهند.
5. این منجر به نسل جهش یافته های فرار می شود.
6. مسائل مربوط به سیستم های رفاه حیوانات.

تلقیح به تخم جنین شده

• در سال 1931 برای اولین بار از تخم مرغ جنین شده برای کشت ویروس استفاده شد.
• روند کشت ویروس ها در تخم های جنینی بستگی به نوع تخمی دارد که استفاده می شود.
• ویروس ها به جنین جوجه 12-7 روزه تلقیح می شوند.
• برای تلقیح، ابتدا تخم‌ها را برای کشت آماده می‌کنند، ابتدا سطح پوسته را باید ضد عفونی می‌کنند و با یک مته کوچک استریل به آن نفوذ می‌کنند.
• پس از تلقیح، دهانه با ژلاتین یا پارافین بسته شده و در دمای 36 درجه سانتیگراد به مدت 2-3 روز انکوبه می شود.
• پس از انکوباسیون، تخم مرغ شکسته شده و ویروس از بافت تخم مرغ جدا می شود.
• رشد و تکثیر ویروس در جنین تخمک با مرگ جنین، آسیب سلولی جنین، یا با تشکیل پوکه ها یا ضایعات معمولی روی غشای تخم مشخص می شود.
• ویروس ها را می توان در قسمت های مختلف تخم مرغ مانند غشای کوریوآلانتوئیک، حفره آلانتوئیک، کیسه آمنیوتیک و کیسه زرده کشت کرد.

غشای کوریوآلانتوئیک (CAM):

• تلقیح عمدتاً برای رشد ویروس آبله است.
• پس از انکوباسیون، ضایعات قابل مشاهده ای به نام پوک (pocks) مشاهده می شود که ناحیه سفید خاکستری در CAM شفاف است.
• ویروس هرپس سیمپلکس نیز رشد می کند.
• این روش برای مطالعات پلاک نیز مناسب است.

حفره آلانتوئیک

تلقیح عمدتاً برای تولید واکسن ویروس آنفلوانزا، تب زرد، هاری انجام می شود.

اکثر ویروس های پرندگان را می توان با استفاده از این روش جدا کرد.

کیسه آمنیوتیک

• تلقیح عمدتاً برای جداسازی اولیه ویروس آنفولانزا و ویروس اوریون انجام می شود.
• رشد و تکثیر ویروس در جنین تخم مرغ با روش هماگلوتیناسیون قابل تشخیص است.

تلقیح کیسه زرده

• ساده ترین روش برای رشد و تکثیر ویروس است.
• برای کشت برخی ویروس ها و برخی باکتری ها (کلامیدیا، ریکتزیا) تلقیح می شود.
• مکانیسم تداخل ایمنی را می توان در اکثر ویروس های پرندگان تشخیص داد.

مزایای تلقیح تخم مرغ جنینی

1. روشی پرکاربرد برای جداسازی و رشد ویروس.
2. بستری ایده آل برای رشد و تکثیر ویروس.
3. جداسازی و پرورش بسیاری از ویروس های پرندگان و تعداد کمی از پستانداران.
4. مقرون به صرفه و نگهداری بسیار آسان.
5. نیاز به نیروی کار کمتر.
6. در دسترس بودن راحت تخم های جنین شده.
7. استریل و طیف وسیعی از بافت ها و مایعات.
8. عاری از باکتری های آلوده کننده و بسیاری از ویروس های نهفته.
9. دخیل نبودن عوامل دفاعی اختصاصی و غیر اختصاصی در تخم‌های جنین.
10. استفاده به طور گسترده برای رشد ویروس برای تولید برخی واکسن.

مضرات تلقیح تخم مرغ جنینی

محل تلقیح با ویروس های مختلف متفاوت است. یعنی هر ویروسی مکان های متفاوتی برای رشد و تکثیر خود دارد.

کشت سلولی (کشت بافت)

سه نوع کشت بافت وجود دارد: کشت اندام، کشت ریزنمونه و کشت سلولی.

• کشت های اندام عمدتاً برای انگل های بسیار تخصصی اندام های خاص انجام می شود.
• کشت ریزنمونه به ندرت انجام می شود.
• کشت سلولی بیشتر برای شناسایی و پرورش ویروس ها استفاده می شود.

کشت سلولی فرآیندی است که طی آن سلول ها تحت شرایط کنترل شده رشد می کنند.
سلول ها در شرایط آزمایشگاهی روی شیشه یا یک سطح پلاستیکی استریل شده در یک محیط رشد مناسب رشد می کنند.
در انکوباسیون، سلول تقسیم می شود و روی سطح فلاسک پخش می شود تا یک تک لایه به هم پیوسته تشکیل شود.

انواع کشت سلولی

کشت سلولی اولیه

اینها سلولهای طبیعی هستند که از سلولهای حیوانی یا انسانی به دست می آیند.
آنها فقط برای مدت محدودی قادر به رشد هستند و نمی توانند در کشت مداوم نگهداری شوند.
آنها برای جداسازی اولیه ویروس ها و تولید واکسن استفاده می شوند.
مثال: کشت سلول کلیه میمون، کشت سلول آمنیون انسانی

کشت سلولی دیپلوئید (خطوط سلولی نیمه پیوسته)

آنها دیپلوئید هستند و تعداد کروموزوم های مشابه سلول های والد را دارند.
آنها را می توان تا 50 بار کشت داد.
آنها برای جداسازی برخی از ویروس های سختگیر و تولید واکسن های ویروسی استفاده می شوند.
مثال: سویه ریه جنینی انسان، سویه سلولی جنینی Rhesus

کشت هتروپلوئید (خطوط سلولی پیوسته)

آنها از سلول های سرطانی مشتق شده اند.
آنها را می توان به طور نامحدود به صورت سریالی کشت کرد که به عنوان رده های سلولی پیوسته نامیده می شود
آنها را می توان با کشت های سریالی یا با نگهداری در انجماد عمیق در دمای 70- درجه سانتی گراد نگهداری کرد.
به دلیل مشتق شدن از سلول های سرطانی برای تولید واکسن مفید نیستند.
مثال: HeLa (سرطان سلولی دهانه رحم انسانی)، HEP-2 (Humman Epithelioma رده سلولی حنجره)، Vero (میمون Vervet) رده های سلولی کلیه، BHK-21 (رده سلولی کلیه بچه هامستر).

مزایای کشت سلولی

• سهولت نسبی
• طیف گسترده
• ارزان تر
• و حساسیت بالاتر

مضرات کشت سلولی

• این فرآیند به تکنسین های آموزش دیده با تجربه در کار به صورت تمام وقت نیاز دارد.
• آزمایشگاه های بهداشت دولتی و آزمایشگاه های بیمارستانی ویروس ها را در کار بالینی جداسازی و شناسایی نمی کنند.
• بافت یا سرم برای تجزیه و تحلیل برای شناسایی ویروس به آزمایشگاه های مرکزی فرستاده می شود.

کشت ویروس های گیاهی و باکتریوفاژها

کشت ویروس های گیاهی
روش‌هایی برای کشت ویروس‌های گیاهی مانند کشت بافت گیاهی، کشت سلول‌های جدا شده یا کشت پروتوپلاست‌ها و غیره وجود دارد.
ویروس ها را می توان در گیاهان کامل رشد داد.

برگها به صورت مکانیکی با مالش با مخلوطی از ویروس ها و مواد ساینده تلقیح می شوند. هنگامی که دیواره سلولی توسط مواد ساینده شکسته می شود، ویروس ها مستقیماً با غشای پلاسما تماس می گیرند و سلول های میزبان در معرض را آلوده می کنند. یک ضایعه نکروز موضعی اغلب به دلیل مرگ سریع سلول ها در ناحیه عفونی ایجاد می شود. برخی از ویروس های گیاهی تنها در صورتی قابل انتقال هستند که قسمتی از بیماری به گیاه سالم پیوند زده شود.

کشت باکتریوفاژها

باکتریوفاژها در کشت‌های براث یا آگار سلول‌های باکتریایی جوان و فعال در حال رشد کشت می‌شوند.

• مطالب مفید:

محیط کشت ویروس

محیط انتقال ویروس