وکتور برای بیان‌ ژن

وکتور ، در زیست شناسی مولکولی، به یک مولکول DNA اطلاق می شود که مواد ژنتیکی را به سلول دیگری منتقل می کند و ماده ژنتیکی در ژنوم سلول گنجانده شده و بیان می شود. DNA خارجی که توسط ناقل حمل می شود DNA نوترکیب نامیده‌می‌شود. وکتور ها به طور کلی با سه عامل مانند منشاء همانندسازی (origin of replication)، جایگاه کلونینگ چندگانه (Multiple cloning site) و یک نشانگر انتخابی (selective marker) مشخص می شوند.

پلاسمید ها و باکتریوفاژها معمولاً به عنوان وکتور های مولکولی مورد‌استفاده قرار می‌گیرند که به شرح زیر می‌باشد:

پلاسمیدها

پلاسمیدها مولکول DNA حلقوی هستند که به طور مستقل در داخل سلول باکتری وجود دارد و دارای یک یا چند ژن است. این ژن ها اغلب نقش مهمی در باکتری میزبان دارند. برای نشان دادن، پلاسمیدهای باکتریایی عمدتا حاوی ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک هستند که از باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک هایی مانند آمپی سیلین محافظت می کنند. در مهندسی ژنتیک، ژن مقاوم به آنتی بیوتیک به عنوان یک نشانگر انتخابی عمل می کند تا بفهمد آیا پلاسمید در سلول باکتری منتقل می شود یا خیر. جدای از آن، بیشتر پلاسمیدها حاوی یک توالی DNA خاص به نام مبدا همانندسازی هستند که به تکثیر مستقل پلاسمیدها کمک می کند. برخی از پلاسمیدها اغلب از آنزیم سلول میزبان برای همانندسازی استفاده می‌کنند، در حالی که برخی می‌توانند نوع خاصی از آنزیم‌های خود را برای همانندسازی کدنویسی کنند.

عوامل مهم برای انتخاب یک وکتور

1. اندازه و شماره کپی

2. هم یوغی و سازگاری

1. اندازه و شماره کپی

اندازه پلاسمیدها از 1 کیلو باز تا 250 کیلو باز متغیر است. اما اندازه پلاسمید برای اهداف شبیه سازی مهم است. همه انواع پلاسمیدها به عنوان یک وکتور شبیه سازی مفید نیستند. پلاسمیدهایی با اندازه کمتر از 10 کیلو باز می توانند به عنوان ناقل استفاده شوند. با این حال، در برخی موارد، پلاسمیدهای بزرگتر نیز می توانند به عنوان وکتور درگیر شوند. شماره کپی به تعداد مولکول های پلاسمید موجود در یک سلول باکتری خاص اشاره دارد. پلاسمیدهای بزرگتر معمولاً سختگیر هستند و اغلب در تعداد کم وجود دارند در حالی که پلاسمیدهای کوچک معمولاً در تعداد زیاد وجود دارند. تعداد زیاد پلاسمیدها به ترکیب چند DNA نوترکیب در یک سلول کمک می کند.

2. هم یوغی و سازگاری

کونژوگه فرآیندی است که طی آن پلاسمیدهای باکتریایی می توانند از یک سلول به سلول دیگر منتقل شوند. پلاسمیدهای مزدوج در فرآیند کونژوگاسیون جنسی دخالت دارند. از سوی دیگر، پلاسمیدهای غیر مزدوج نیز در سلول های باکتریایی وجود دارند. پلاسمیدهای غیر مزدوج فاقد نوعی ژن به نام tra gene هستند که در انتقال پلاسمیدها از طریق کونژوگه نقش دارد و در پلاسمیدهای مزدوج وجود دارد. یک سلول باکتری می تواند چندین نوع پلاسمید داشته باشد که در بین آنها انواع مختلفی از پلاسمیدهای مزدوج نیز وجود دارد. در این مورد، فرآیند انتقال نیاز به سازگاری پلاسمیدهای موجود در یک سلول باکتریایی دارد. دو پلاسمید ناسازگار در داخل یک سلول وجود نخواهد داشت. یکی یا دیگری گم خواهد شد از این رو، سازگاری پلاسمیدها نقش مهمی در انتخاب ناقل های شبیه سازی دارد.

انواع پلاسمیدها

پلاسمیدهای طبیعی بر اساس ژن‌های موجود در پلاسمیدها در پنج گروه اصلی طبقه‌بندی می‌شوند. این پنج گروه عبارتند از:

پلاسمید F یا باروری

پلاسمید‌F به طور خاص حاوی ژن tra است و انتقال پلاسمیدها را از طریق کونژوگه تسهیل می کند.

پلاسمید R یا مقاومت

این نوع پلاسمید حاوی یکی از چندین ژن مقاومت آنتی بیوتیکی است. در میکروبیولوژی بالینی، پلاسمید R نقش مهمی را ایفا می کند زیرا دلیل اصلی ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی در پاتوژن های باکتریایی است. نمونه ای از این پلاسمید R پلاسمید RP4 است که معمولاً در Pseudomonas sp وجود دارد.

Col Plasmid

پلاسمیدهای Col مسئول تولید کولیسین هستند و معمولاً در برخی از سویه های E. coli یافت می شوند. این نوعی سم است که عموماً در محیط برای کاهش رقابت برای تغذیه آزاد می شود. ColE1 نمونه ای از این نوع پلاسمید است که در E.coli یافت می شود.

پلاسمید تجزیه‌کننده

این نوع پلاسمید مسئول تجزیه ترکیبات پیچیده مانند تولوئن، اسید سالیسیلیک است. مثال: TOL موجود در Pseudomonas putida.

پلاسمید ویرولانس یا حدت

پلاسمیدهای ویروسی در باکتری های بیماری زا وجود دارند و مسئول ایجاد عفونت یا بیماری در سلول میزبان هستند. پلاسمید Ti نمونه ای از پلاسمید حدت است که در Agrobacterium tumefaciens وجود دارد و در گیاهان دو لپه ای باعث بیماری کیسه تاج می شود.

باکتریوفاژ

باکتریوفاژها گروهی از ویروس ها هستند که از سلول های باکتریایی به عنوان میزبان استفاده‌می‌کنند و با آلوده‌کردن سلول های باکتریایی تکثیر می شوند. مانند سایر ویروس ها، باکتریوفاژها نیز از یک پوشش پروتئینی تشکیل شده‌اند که از ژنوم محافظت می کند. بیشتر فاژها ویروس های DNA هستند که چندین ژن مسئول تکثیر ویروس را کد می کنند. مشکل اصلی استفاده از پلاسمیدها به عنوان یک وکتور کلونینگ، کوچک بودن اندازه ژن مورد نظر است. با این حال، باکتریوفاژها به غلبه بر این مشکل کمک می کنند، زیرا ژن های بزرگتر را می توان با استفاده از باکتریوفاژ به عنوان یک ناقل شبیه سازی منتقل کرد.

فاژهای لیتیک و لیزوژنیک

الگوی عفونت باکتریوفاژهای مختلف برای تکمیل بیشتر به سه مرحله نیاز است. اولاً، اتصال فاژ در محل خاصی از باکتری صورت می گیرد. سپس فاژ به DNA داخل سلول باکتری تزریق می شود. در مرحله دوم، ژن های موجود در DNA فاژ چندین آنزیم را کد می کنند که به تکثیر DNA فاژ کمک می کند. در نهایت، ژن های دیگر نیز چندین پروتئین را کد می کنند که توسط آنها کپسید تشکیل‌شده و ذره فاژ جدید در داخل کپسید جمع می شود. این مرحله با لیز سلول و آزاد شدن فاژها از سلول دنبال می شود. در چندین باکتریوفاژ این چرخه به سرعت رخ می دهد و به آن چرخه لیتیک می گویند.

از سوی دیگر، در برخی از فاژها، DNA فاژ پس از ورود به سلول میزبان وارد ژنوم میزبان شد و برای چندین تقسیم سلولی در آنجا باقی می ماند. DNA فاژی که در DNA باکتری ادغام‌شده است پروفاژ نامیده می شود و ساکن است.

باکتری‌هایی که DNA فاژ را حمل می کنند مانند سایر سلول های غیر عفونی باقی می مانند. این نوع عفونت چرخه لیزوژنیک نامیده‌می‌شود. DNA فاژ در نهایت با ورود به چرخه لیتیک از سلول میزبان آزاد می شود. چرخه عفونت فاژ لامبدا یک مثال عالی از چرخه لیزوژنیک است. در مورد شبیه‌سازی، چرخه لیزوژنیک بسیار مهم است، زیرا DNA فاژ می‌تواند حامل یک ژن خاص باشد که بیشتر در ژنوم میزبان گنجانده‌شده‌است. در نتیجه، ژنوم میزبان یک ژن خاص را که توسط فاژ حمل می شود، کد می کند. بنابراین فاژهای لامبدا بیشتر به عنوان وکتور شبیه‌سازی استفاده‌می‌شوند.

سازمان ژنتیکی DNA لامبدا

فاژ لامبدا یک نمونه معمولی از باکتریوفاژ است که دارای سر و دم چند وجهی است. DNA توسط ساختار چند وجهی محافظت می شود و دم با محل خاصی از باکتری ها برای اتصال تعامل می کند. فاژ لامبدا معمولاً E.coli را آلوده‌می‌کند. اندازه DNA لامبدا فاژ 49 کیلوبایت است. نقشه برداری ژن و تجزیه و تحلیل توالی DNA تمام اطلاعات مربوط به آرایش ژنتیکی DNA فاژ را فراهم می کند. بر اساس داده‌های جمع‌آوری‌شده از این تجزیه و تحلیل‌ها، ژن‌های عملکردهای مشابه در ژنوم در کنار هم قرار می‌گیرند. برای نشان دادن، ژن‌های مسئول تشکیل کپسید در سمت چپ سر چند وجهی با هم دسته‌بندی می‌شوند در حالی که ژن‌های مسئول ترکیب DNA فاژ با ژنوم میزبان در وسط قرار دارند.

اشکال خطی و دایره‌ای DNA لامبدا

تشکیل DNA لامبدا نقش مهمی را به عنوان یک وکتور ناقل ایفا می کند. ژنوم فاژ لامبدا از دو DNA خطی مکمل تشکیل شده‌است. از آنجایی که رشته های DNA مکمل یکدیگر هستند، به یکدیگر متصل می شوند و DNA دو رشته‌ای دایره‌ای شکل می دهند. در زیست شناسی مولکولی، اصطلاح انتهای چسبنده به رشته های تک مکملی که به هم متصل می‌شوند اشاره دارد.

در DNA لامبدا انتهای چسبنده به عنوان  cos site نامیده‌می‌شود که نقش اساسی در چرخه عفونت ایفا می کند. درمرحله اول، DNA فاژ پس از قرار دادن در داخل سلول باکتریایی، به دلیل مکان‌های cos دایره‌ای باقی می‌ماند. سپس، نقش دوم سایت‌های cos نسبتاً متفاوت است و پس از جداسازی پروفاژ از ژنوم میزبان نقش خود را ایفا می کند.

در این مرحله، تعداد زیادی مولکول DNA لامبدا جدید توسط همانند سازی چرخشی تولید می‌شود، که در آن یک رشته DNA پیوسته از مولکول الگو خارج می‌شود. در نتیجه یک کاتنان متشکل از یک سری ژنوم خطی لامبدا در سایت‌های cos به هم ملحق می شوند. نقش سایت‌های cos این است که به‌عنوان توالی‌های شناسایی برای یک اندونوکلئاز عمل کنند، کاتنان را در مکان‌های cos می‌شکافد و ژنوم‌های لامبدا را تولید می‌کند. این اندونوکلئاز که محصول ژن A بر روی مولکول DNA لامبدا است، انتهای چسبنده تک رشته‌ای را ایجاد می کند و در ارتباط با پروتئین های دیگر برای بسته بندی هر ژنوم لامبدا در ساختار سر فاژ عمل می کند.

فرآیندهای برش و بسته‌بندی فقط مکان‌های cos و توالی‌های DNA را در دو طرف آن‌ها تشخیص می‌دهند، بنابراین با تغییر ساختار نواحی داخلی ژنوم لامبدا، مثلا با قرار دادن ژن‌های جدید، تا زمانی که طول کلی ژنوم لامبدا خیلی تغییر نکرده‌است، اثرگذار نیست.

M-13: فاژ رشته‌ای

M-13 یک نوع باکتریوفاژ است و کاملاً با فاژهای لامبدا متفاوت است. ساختار رشته ای است، اندازه ژنوم بسیار کوچک (6407 نوکلئوتید)، تک رشته ای است و به صورت دایره ای باقی می ماند. به دلیل اندازه کوچک DNA، ژنوم فاژ می تواند تنها چند ژن نوترکیب را حمل کند. DNA فاژ M-13 از طریق پیلوس وارد سلول E. coli می شود. در داخل سلول، DNA فاژ برای آنزیم های خاصی که رشته مکمل DNA را سنتز می کنند، کد می کند. این مولکول DNA دو رشته ای تازه تشکیل شده سپس به چندین نسخه تکثیر می شود. در طول تقسیم سلولی باکتری، هر سلول دختر حاوی کپی هایی از DNA فاژ است و DNA فاژ به تکثیر در داخل سلول های دختر ادامه می دهد. در نهایت، ذرات فاژ جدید جمع آوری شده و از سلول باکتری آزاد می شوند.

فاژهای M-13 نیز به عنوان یک وکتور شبیه سازی استفاده می شوند. اندازه ژنوم 10 کیلوبایت است که برای وارد کردن ژن‌های جدید کافی است. جدای از آن، تغییر DNA تک‌رشته‌ای به DNA دو رشته‌ای در داخل میزبان، آن را منحصربه‌فرد می‌کند.