ام آر اس آگار
Ⅰ. بررسی اجمالی ام آر اس آگار
Ⅱ. تهیه / ترکیب آگار MRS
Ⅲ. اصول
Ⅳ. استفاده
Ⅴ. تفسیر
Ⅰ. بررسی اجمالی ام آر اس آگار
MRS آگار(از De Man، Rogosa و Sharpe) برای تشخیص و شمارش لاکتوباسیلوس در محصولات لبنی و سایر محصولات غذایی و همچنین در محصولات در نظر گرفته شده برای خوراک دام استفاده می شود. محیط MRS امکان رشد فراوان تری را در تمامی سویه های لاکتوباسیل و به ویژه سویه هایی با رشد کند و دشوار مانند L. brevis و L. fermenti فراهم می کند. هنگامی که به pH 5.4 اسیدی می شود، می توان از MRS Agar برای شمارش لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در ماست استفاده کرد. این محیط قهوه ای روشن که در سال 1960 ساخته شد، به افتخار مخترعان آن، یوهانس کورنلیس د من، موریسون روگوسا و مارگارت الیزابت شارپ نامگذاری شد.
Ⅱ. تهیه / ترکیب آگار MRS
- اجزای تشکیل دهنده، را در آب حل کنید(70 گرم در 1000 میلی لیتر آب تصفیه شده / مقطر).
- محیط را با هم زدن مداوم حداقل به مدت 1 دقیقه به جوش بیاورید.
- در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید.
- سپس تا دمای 50-45 درجه سانتیگراد خنک کنید.
- قبل از ریختن pH را به صورت غیر عفونی تنظیم کنید.
| gram / litre | Ingredients | gram / litre | Ingredients |
|---|---|---|---|
| 5gr | Sodium acetate | 10gr | Peptone |
| 0.1gr | Magnesium sulfate | 5gr | Yeast extract |
| 0.05gr | Manganese sulfate | 10gr | Meat extract |
| 2gr | Disodium phosphate | 20gr | Glucose |
| 15gr | Agar | 1gr | Polysorbate 80 |
محیط ام آر اس آگار برای لاکتوباسیل ها انتخابی است اما ممکن است مقداری رشد لوکونوستوک و پدیوکوک رخ دهد. انتخاب پذیری را می توان با تنظیم pH تغییر داد. لاکتوباسیل ها سطوح pH کمتری را نسبت به استرپتوکوک ها (pH 5.0-6.5) تحمل می کنند و پدیوکوک ها و لوکونوستوک ها در این محدوده بهترین رشد را دارند.
“باکتری های اسید لاکتیک” شامل گونه هایی از جنس های زیر است: لاکتوباسیلوس، استرپتوکوک، پدیوکوکوس و لوکونوستوک. همه این گونه ها می توانند اسید لاکتیک را در مقادیر قابل توجهی تولید کنند.
آنها گرم مثبت، کاتالاز و اکسیداز منفی هستند و در نیازهای تغذیه ای خود سختگیر هستند. رشد به طور قابل توجهی توسط شرایط میکرو هوازی افزایش می یابد.
Ⅲ. اصول
- تغذیه با ترکیبی از پپتون ها، گلوکز، عصاره گوشت گاو و عصاره مخمر تامین می شود.
- پلی سوربات 80 اسیدهای چرب لازم برای متابولیسم لاکتوباسیل ها را فراهم می کند.
- انتخاب پذیری در برابر استرپتوکوک ها و کپک ها توسط سیترات آمونیوم و استات سدیم ایجاد می شود. سیترات آمونیوم که در pH پایین استفاده می شود، امکان رشد لاکتوباسیل ها را فراهم می کند و در عین حال تعدادی از گروه های دیگر میکروارگانیسم ها را مهار می کند.
- سولفات منیزیم و سولفات منگنز یون های ضروری برای تکثیر لاکتوباسیل ها را فراهم می کنند.
- گلوکز کربوهیدرات قابل تخمیر موجود در محیط است.
- پتاسیم فسفات عامل بافر است.
- رشد ارگانیسم با کدورت روی محیط و تولید گاز در طی تخمیر قند با حباب های روی لوله دورهام در محیط مایع نشان داده می شود.
Ⅳ. استفاده
- 1 میلی لیتر از نمونه رقیق شده را در ظروف پتری استریل قرار دهید و ام آر اس آگار (15 تا 20 میلی لیتر) را که در دمای 45 درجه سانتیگراد ذوب شده است، اضافه کنید، سپس خوب مخلوط کنید.
- پس از انجماد، ظرف مدت 15 دقیقه، یک لایه جدید از آگار MRS (15 میلی لیتر) بدون تلقیح روی سطح اضافه کنید و اجازه دهید تا جامد شود. داشتن یک جو مرطوب کافی در بالای آگار مهم است، به طوری که در طول انکوباسیون خشک نشود (این باعث می شود عوامل انتخابی روی سطح متمرکز شوند و محیط بازدارنده شود).
- به مدت 3 روز در دمای 25 درجه سانتیگراد یا 2 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد، بسته به نوع فلور مورد نظر، در جوی غنی شده با 5٪ CO2 انکوبه کنید.
Ⅴ. تفسیر
◈ لاکتوباسیل ها به صورت کلنی های سفید بزرگی که در ام آر اس آگار یا روی آن جاسازی شده اند ظاهر می شوند. با توجه به احتمال رشد میکروب‌هایی غیر از باکتری‌های اسید لاکتیک، ممکن است در برخی موارد لازم باشد زیر میکروسکوپ بررسی شود که واقعاً باسیل‌های گرم مثبت و غیر اسپورساز هستند.
◈ در محیط مایع
- تست مثبت: Lactobacillus spp. – رشد (کدورت در محیط)، عدم تولید گاز
- تست مثبت: Leuconostoc sp. – رشد، تولید گاز با حباب در لوله دورهام نشان داده شده است.
- تست منفی: بدون کدورت (بدون رشد)، عدم تولید گاز
موارد استفاده از محیط کشت ام آر اس آگار
- برای شناسایی برخی گونه های لاکتوباسیلوس استفاده می شود و Leuconostoc sp که گاز تولید می کنند.
- معمولاً برای شناسایی لاکتوباسیل ها از حفره دهان، محصولات لبنی، غذاها، مدفوع و سایر منابع انجام می شود.
محدودیت های استفاده از محیط کشت
- توصیه می شود برای شناسایی کامل، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف سنجی جرمی روی کلنی های حاصل از کشت خالص انجام شود.
- با توجه به نیازهای تغذیه ای متفاوت، ممکن است برخی از سویه ها مشاهده شوند که رشد ضعیفی دارند یا در این محیط رشد نمی کنند.
- ممکن است موجوداتی غیر از لاکتوباسیل ها در این محیط رشد کنند. جدایه ها باید به عنوان لاکتوباسیل با آزمایش های بیوشیمیایی مناسب تایید شوند.
“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.
