آزمایش تخمیر کربوهیدرات (تست تخمیر قند)

آزمایش تخمیر کربوهیدرات ، آزمایش بیوشیمیایی است که برای ارزیابی توانایی باکتری ها در تخمیر کربوهیدرات خاص و تمایز باکتری ها بر اساس الگوی تخمیر کربوهیدراتی آنها و شناسایی آنها استفاده می شود. 

همه گروه های باکتریایی نیازهای تغذیه ای و خواص بیوشیمیایی یکسانی ندارند. باکتری های مختلف ممکن است سیستم های آنزیمی متفاوتی داشته باشند که آنها را در توانایی استفاده از سوبسترا متفاوت می کند. الگوی مشابهی در کربوهیدرات ها (قندها) با استفاده از توانایی باکتری ها دیده می شود – برخی می توانند از یک نوع قند استفاده کنند در حالی که برخی دیگر اصلاً نمی توانند از آن استفاده کنند. همچنین، نحوه متابولیسم همان قند و محصولات نهایی متابولیسم ممکن است در گروه های مختلف باکتری متفاوت باشد – برخی می توانند از حالت تخمیری استفاده کنند در حالی که برخی می توانند از حالت متابولیسم اکسیداتیو استفاده کنند، برخی اسیدها را به عنوان محصول نهایی تولید می کنند در حالی که برخی تولید الکل می کنند، برخی ممکن است گاز آزاد کنند، در حالی که برخی ممکن است گاز تولید نکنند.

کربوهیدرات ها

کربوهیدرات ها که به سادگی قند نامیده می شوند، پلی هیدروکسی آلدئیدها یا کتون هایی هستند که از اتم های کربن (C)، هیدروژن (H) و اکسیژن (O) ترکیب شده در ترکیبی تجربی از Cx(H2O)y تشکیل شده اند. انواع مختلفی از کربوهیدرات ها بر اساس پایه های مختلف طبقه بندی می شوند. با این حال، در آزمایشات میکروبیولوژی و تخمیر کربوهیدرات، گلوکز، لاکتوز، ساکارز، مالتوز، مانیتول، گالاکتوز، نشاسته، رامنوز، اسکولین، سالیسین، آدونیتول، دولسیتول، سوربیتول، سلوبیوز، زایلوز، مانوز، ترهالوز، اینوزیتول، رافینوز، ملیبوز و سلولز معمولاً به عنوان بستر استفاده می شود.

در طی فرآیند تخمیر، مولکول های کربوهیدرات به صورت بی هوازی به اسیدهای آلی کاتابولیز می شوند. بنابراین اسید تولید شده PH محیط را کاهش می دهد و نشانگر PH را وادار به تغییر رنگ می کند.

اما همه باکتری ها توانایی تخمیر کربوهیدرات های فوق را ندارند. برخی از گونه های باکتری می توانند برخی از این کربوهیدرات ها را تخمیر کنند در حالی که برخی ممکن است آنها را تخمیر نکنند. این توانایی باکتری برای تخمیر یک کربوهیدرات خاص می تواند برای طبقه بندی باکتری ها به گروه های مختلف و کمک به فرآیند شناسایی باکتری استفاده شود. آزمایشی که برای تعیین الگوی تخمیر کربوهیدرات و توانایی یک میکروارگانیسم استفاده می شود، آزمایش تخمیر کربوهیدرات نامیده می شود.

اهداف آزمایش تخمیر کربوهیدرات

• برای ارزیابی توانایی باکتری ها در تخمیر کربوهیدرات خاص.
• تمایز باکتری ها بر اساس الگوی تخمیر کربوهیدرات آنها و شناسایی آنها.

اصول آزمایش تخمیر کربوهیدرات

باکتری های مختلف توانایی های متفاوتی برای تخمیر کربوهیدرات های خاص دارند – برخی می توانند یک نوع کربوهیدرات را تخمیر کنند در حالی که برخی دیگر نمی توانند همان قند را تخمیر کنند. در حین تخمیر کربوهیدرات ها، اسیدهای آلی به عنوان محصولات نهایی تولید می شوند. این اسیدهای تولید شده باعث کاهش PH محیط می شوند. این کاهش pH باعث تغییر رنگ نشانگر pH موجود در محیط می شود. (تغییر رنگ به نوع نشانگر pH مورد استفاده در آزمایش بستگی دارد.)

اگر باکتری ها در حین تخمیر کربوهیدرات گازهایی آزاد کنند، به عنوان یک حباب هوا در لوله دورهام معکوس/لوله تخمیر که در داخل محیط تخمیر غوطه ور است، به دام می افتند.

این تغییر رنگ نشان‌دهنده وقوع تخمیر و تشکیل حباب هوا در لوله دورهم نشان‌دهنده آزاد شدن گاز است و از این رو، تایید می‌کند که باکتری‌های مورد آزمایش قادر به استفاده از کربوهیدرات خاص مورد استفاده در محیط آزمایش بوده‌اند.

الزامات آزمایش تخمیر کربوهیدرات

1. محیط کشت
2. کربوهیدرات
3. معرف ها
4. تجهیزات
5. موجودات آزمایشی (نمونه باکتری)

• محیط کشت

برای انجام این آزمایش می توان از محیط کربوهیدرات استفاده کرد. ترکیب محیط را می توان با توجه به ارگانیسم مورد آزمایش و منبع یا اجزای موجود در آزمایشگاه تغییر داد. در این مقاله از ترکیبی بر اساس “محیط پایه مصرفی کربوهیدرات” HiMedia (M124) با تغییر خاصی در نشانگر PH استفاده می کنیم و کربوهیدرات های خاصی را اضافه می کنیم.

ترکیب محیط پایه کربوهیدرات در 990 میلی لیتر

• پروتئاز پپتون – 10.00 گرم
• HM Peptone B (عصاره گوشت گاو) – 1.00 گرم
• کلرید سدیم – 5.00 گرم
• فنل قرمز – 0.018 گرم
• (به طور متناوب می توان از بروموکرزول بنفش 0.100 گرم استفاده کرد)

تهیه محیط کربوهیدرات

• مقدار مناسب اجزای محیط را اندازه گیری کرده و در 990 میلی لیتر آب مقطر حل کنید.
• 10 گرم کربوهیدرات خاص برای آزمایش اضافه کنید و با تکان دادن حل کنید.
• در صورت نیاز برای حل شدن کامل اجزا، حرارت دهید تا بجوشد.
• حدود 5 تا 7 میلی لیتر (یا حجم مورد نیاز برای غوطه ور کردن لوله دورهام) از محیط را در لوله های آزمایش بریزید.
• یک لوله دورهمی را به طور کامل در هر لوله فرو کنید و مطمئن شوید که هیچ حباب هوا در داخل لوله دورهمی زیر آب وجود ندارد.
• کلاهک یا پلاگین پنبه ای را آزاد بگذارید و لوله ها را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 15 پوند اتوکلاو کنید.

کربوهیدرات ها

گلوکز، لاکتوز، ساکارز، مالتوز، مانیتول، گالاکتوز، نشاسته، رامنوز، اسکولین، سالیسین، آدونیتول، دولسیتول، سوربیتول، سلوبیوز، زایلوز، مانوز، ترهالوز، اینوزیتول، رافینوز، ملیبیوز و سلولز کربوهیدرات هایی هستند که معمولاً به عنوان سوبسترا در آزمایش تخمیر کربوهیدرات استفاده می شوند.

معرف ها

نشانگرهای pH برای تشخیص تولید اسید در محیط مورد نیاز است. شاخص های مختلف pH را می توان استفاده کرد مانند:

Andrade’s Indicator: صورتی روشن در محدوده PH خنثی (7.1 تا 7.2)، صورتی تیره تا قرمز در pH اسیدی (در حدود یا کمتر از 5.0) و در pH قلیایی بالا (حدود 12 تا 14) زرد می شود.

فنل قرمز: نارنجی مایل به قرمز در حالت خنثی (حدود 7.4 pH)، در pH اسیدی (در pH و کمتر از 6.8) زرد می شود و در pH قلیایی (در pH یا بالاتر از 8.4) صورتی مایل به قرمز می شود.

بروموکرزول بنفش: بنفش تیره در حدود خنثی (حدود 7.4 pH)، در pH اسیدی (در pH و کمتر از 5.2) زرد می شود و در pH قلیایی (در pH و بالاتر از 6.8) بنفش می شود.

بروموتیمول آبی: سبز در pH خنثی (حدود 7.0 pH)، در pH اسیدی (در pH و کمتر از 6.0) زرد می‌شود و در pH قلیایی (در pH و بالاتر از 8.4) به رنگ آبی پروس در می‌آید.

بر اساس محدوده pH برای تغییر رنگ، سمیت، سهولت مشاهده تغییر و در دسترس بودن، فنل قرمز ترجیح داده شده ترین شاخص pH است.

تجهیزات

• لوله های آزمایش
• لوپ تلقیح
• دستگاه ترازو
• اتوکلاو و انکوباتور
• لوله های دورهم
• چراغ بنزن

PPE و سایر مواد آزمایشگاهی عمومی

موجودات آزمایشی (نمونه باکتری)

آزمایش تخمیر کربوهیدرات همچنین برای تمایز گونه‌های مخمر مانند .Candida spp و .Saccharomyces spp استفاده می‌شود؛ بنابراین، موجودات مورد آزمایش ممکن است مخمرها باشند.

روش آزمایش تخمیر کربوهیدرات

1. با استفاده از یک حلقه لوپ استریل، یک کلنی به خوبی ایزوله شده از کشت تازه (کشت 18 تا 24 ساعته) از باکتری های نمونه بردارید و محیط را تلقیح کنید.
2. لوله ها را در دمای 2±35 درجه سانتی گراد به مدت 18 تا 24 ساعت انکوبه کنید.
3. تغییر رنگ محیط و حباب های هوای محبوس شده در لوله دورهام را مشاهده کنید.
4. اگر تغییر رنگ یا حباب هوا مشاهده نشد، لوله ها را مجدداً تا 24 ساعت آینده انکوبه کنید و تغییرات رنگ و حباب های هوا را بررسی کنید. برخی ممکن است به انکوباسیون 5 روزه یا بیشتر نیاز داشته باشند.

تفسیر نتایج آزمایش تخمیر کربوهیدرات

• تخمیر مثبت با تغییر رنگ محیط از قرمز مایل به نارنجی به زرد نشان داده می شود.
• تخمیر منفی با عدم تغییر رنگ محیط مشخص می شود (قرمز مایل به نارنجی باقی می ماند).
  (اگر از نشانگر PH دیگری استفاده می شود، تغییر رنگ را مطابق آن بخوانید.)
• تولید گاز با تشکیل حباب هوا در لوله دورهام مشخص می شود.

الگوی تخمیر برخی از باکتری های رایج

احتیاط

• مطمئن شوید که هیچ حباب هوا در لوله دورهمی معکوس وجود ندارد.
• در حین تلقیح، از دست زدن (تلقیح روی) لوله دورهام خودداری کنید. برای اطمینان از توزیع مناسب نمونه در محیط، محیط را بچرخانید.
• برخی ممکن است به انکوباسیون طولانی مدت، تا 5 روز یا حتی بیشتر نیاز داشته باشند، بنابراین پس از 24 ساعت منفی گزارش ندهید.

کاربردهای آزمایش تخمیر کربوهیدرات

1. تمایز باسیل های گرم منفی
2. شناسایی احتمالی باکتری ها
3. تمایز گونه های کاندیدا.

محدودیت های آزمایش تخمیر کربوهیدرات

1. این یک آزمایش تاییدی نیست. از این رو، برای شناسایی کامل نیاز به نتایج آزمایش سایر آزمایشات بیوشیمیایی دارد.
2. انواع مختلفی از کربوهیدرات ها و شاخص ها در دسترس هستند. محیط های زیادی که هر کدام حاوی کربوهیدرات خاصی هستند باید ساخته شوند.
3. اگر نتیجه خیلی دیر خوانده شود، دآمیناسیون اکسیداتیو ممکن است رخ دهد که در نتیجه pH محیط به قلیایی تغییر می کند و نتیجه منفی کاذب ایجاد می کند.
4. ممکن است برای یک واکنش مثبت بیش از 24 ساعت نیاز باشد. اگر نتیجه خیلی زود خوانده شود، می توان نتایج نادرستی به دست آورد.
5. حتی آلودگی جزئی می تواند منجر به یک نتیجه مثبت کاذب شود.