کشت سلول جانوری

• تعریف کشت سلول جانوری
• انواع
• لاین سلولی
• تولید
• کاربرد

کشت سلولی حیوانی چیست؟

کشت سلول جانوری نوعی روش بیوتکنولوژیک است که در آن سلول های حیوانی به طور مصنوعی در یک محیط مساعد رشد می کنند. سلول های مورد استفاده در کشت سلولی حیوانی معمولا از یوکاریوت های چند سلولی و رده های سلولی تثبیت شده آنها به دست می آیند. کشت سلول حیوانی یک تکنیک رایج و پرکاربرد برای جداسازی سلول ها و کشت آنها در شرایط مصنوعی است. این تکنیک به عنوان یک تکنیک آزمایشگاهی برای مطالعات خاص توسعه داده شد. با این حال، از آن زمان برای حفظ خطوط سلولی زنده به عنوان یک موجودیت مجزا از منبع اصلی توسعه یافته است. توسعه تکنیک‌های کشت سلولی حیوانی به دلیل توسعه محیط‌های کشت بافت پایه است که کار طیف گسترده‌ای از سلول‌ها را در شرایط مختلف ممکن می‌سازد. کشت آزمایشگاهی سلول های جدا شده از حیوانات مختلف به کشف عملکردها و مکانیسم های مختلف عملکرد سلول های مختلف کمک کرده است.

برخی از مناطقی که کشت سلول های حیوانی بیشترین کاربرد را پیدا کرده است عبارتند از:

1. تحقیقات سرطان
2. تولید واکسن
3. و ژن درمانی.

رشد سلول‌های حیوانی در محیط‌های مصنوعی نسبت به رشد میکروارگانیسم‌ها روی محیط‌های مصنوعی دشوار است و بنابراین به مواد مغذی و فاکتورهای رشد بیشتری نیاز دارد. با این حال، پیشرفت در محیط های کشت، کشت سلول های تمایز نیافته و تمایز یافته را بر روی محیط های مصنوعی ممکن کرده است. کشت سلول های حیوانی را می توان از پیچیدگی های مختلف سلول ها انجام داد، زیرا ساختارهای پیچیده مانند اندام ها نیز می توانند برای شروع کشت اندام در شرایط آزمایشگاهی استفاده شوند. بسته به هدف و کاربرد تکنیک، می توان از سلول ها، بافت ها یا اندام ها برای فرآیند کشت استفاده کرد.

انواع کشت سلول جانوری

بسته به تعداد تقسیمات سلولی که در طول فرآیند اتفاق می افتد، کشت های سلولی حیوانی را می توان به دو گروه مجزا تقسیم کرد.

1- کشت سلولی اولیه

کشت سلولی اولیه اولین کشت است که مستقیماً از بافت حیوانی از طریق تجزیه مکانیکی و شیمیایی یا روش های آنزیمی به دست می آید. سلول های کشت سلولی اولیه سلول هایی با رشد آهسته هستند که تمام ویژگی های بافت یا سلول های اصلی را حمل می کنند. از آنجایی که این کشت ها مستقیماً از مبدا به دست می آیند، تعداد کروموزوم های آنها برابر با سلول های اصلی است. کشت سلولی اولیه به منظور حفظ و حفظ رشد سلول ها در یک محیط رشد مصنوعی در یک شرایط خاص انجام می شود.

کشت های سلولی اولیه را می توان برای کشت های دیگر به دست آورد که یا به طور نامحدود به رشد خود ادامه می دهند یا پس از چند کشت فرعی می میرند. سابکالچر بعدی کشت سلولی اولیه منجر به ورود جهش به سلول ها می شود که ممکن است منجر به ایجاد رده های سلولی شود. مورفولوژی سلول‌ها در کشت‌های سلولی اولیه ممکن است متفاوت و متنوع باشد، که رایج‌ترین ساختارهای مورفولوژیکی مشاهده شده، نوع اپیتلیوم، نوع اپیتلیوئید، نوع فیبروبلاست و نوع بافت همبند است.

کشت های سلولی اولیه به سختی بدست می آیند و معمولاً طول عمر کمتری دارند. علاوه بر این، اینها مستعد آلودگی توسط باکتری ها و ویروس ها هستند. افزایش تعداد سلول ها در کشت سلولی اولیه می تواند منجر به فرسودگی بستر و مواد مغذی شود که بر فعالیت سلولی تأثیر می گذارد.

معمولاً کشت‌های سلولی اولیه به منظور حفظ رشد مداوم سلولی پس از رسیدن به مرحله تلاقی، باید مجدد کشت شوند.

کشت های سلولی اولیه را می توان بسته به نوع سلول های موجود در کشت به دو گروه تقسیم کرد:

A- سلول‌های وابسته به لنگرگاه / چسبنده

• سلول های موجود در کشت برای چسبندگی و رشد به یک سطح بیولوژیکی پایدار نیاز دارند.
• سطح باید جامد و غیر سمی باشد زیرا رشد این سلول ها به عنوان سوسپانسیون سلولی دشوار است.
• این سلول‌ها معمولاً از بافت‌های اندام‌هایی که سلول‌ها در داخل بافت همبند بی‌حرکت می‌مانند، به دست می‌آیند.
• نمونه هایی از سلول های چسبنده شامل سلول های کلیه و سلول های STO فیبروبلاست موش است.

B- سلول های مستقل از لنگرگاه/ سوسپانسیونی

• این سلول ها می توانند به طور موثر به عنوان سوسپانسیون سلولی رشد کنند و برای اتصال نیازی به سطح جامد ندارند.
• اینها را می توان به طور مداوم روی محیط های مایع کشت کرد تا سابکالچرهای تازه به دست آید.
• توانایی سلول ها برای رشد به صورت سوسپانسیون به منبع سلول ها بستگی دارد زیرا سلول هایی که به صورت سوسپانسیون در بدن باقی می مانند سلول های معلق موثر هستند.
• نمونه هایی از سلول های معلق شامل سلول های خونی هستند که عروقی هستند و در پلاسما معلق می مانند.

2- کشت سلولی ثانویه

کشت سلولی ثانویه پس از کشت سلولی اولیه در طی یک دوره زمانی در محیط کشت تازه به دست می آید. سلول‌های کشت‌های سلولی ثانویه عمر طولانی‌تری دارند، زیرا به دلیل در دسترس بودن مواد مغذی مناسب در فواصل زمانی منظم، طول عمر بیشتری دارند. کشت‌های سلولی ثانویه نسبت به کشت‌های سلولی اولیه ترجیح داده می‌شوند، زیرا این کشت‌ها راحت‌تر در دسترس هستند و رشد و نگهداری آسان‌تر هستند. این سلول ها از درمان آنزیمی سلول های چسبنده و به دنبال آن شستن و تعلیق مجدد سلول ها در حجم های خاصی از محیط تازه تشکیل می شوند.

کشت سلولی ثانویه زمانی تهیه می شود که تعداد سلول ها در کشت اولیه از ظرفیت محیط برای حمایت از رشد بیشتر باشد. کشت ثانویه به حفظ تراکم سلولی بهینه لازم برای رشد مداوم کمک می کند. سلول‌های کشت سلولی ثانویه ممکن است شبیه جهش‌های بافت والدین نباشند و تغییرات ژنتیکی ممکن است در طول فرآیند کشت فرعی ایجاد شود. سلول ها را می توان تبدیل کرد، در برخی موارد، کشت های فرعی مداوم می تواند منجر به سلول های جاودانه شود. با تبدیل سلول ها و کمتر مستعد ابتلا به عفونت، خطر آلودگی توسط باکتری ها و ویروس ها کمتر است. یک عیب مهم مرتبط با کشت سلولی ثانویه این است که سلول ها ممکن است در طی یک دوره زمانی طولانی تمایل به تمایز پیدا کنند و منجر به سلول های نابجا شوند.

لاین های سلولی

رده سلولی به گروهی از سلول ها گفته می شود که از کشت فرعی کشت اولیه متشکل از کشت خالص سلولی تشکیل می شوند. خطوط سلولی معمولاً ویژگی های عملکردی نزدیک به سلول های اولیه را نشان می دهند، اما ژنوتیپ و فنوتیپ سلول ها را می توان تغییر داد.

یک رده سلولی از چندین رده سلولی با فنوتیپ های مشابه یا متفاوت تشکیل شده است.

رده های سلولی را می توان بر اساس الگوهای رشد سلول ها به دو گروه تقسیم کرد:

a- خطوط سلولی محدود

• رده های سلولی محدود، خطوط سلولی هستند که در آن سلول های کشت برای تعداد محدودی تقسیم می شوند و پس از آن در نهایت می میرند.
• سلول های رده های سلولی محدود می توانند از 20 تا 100 بار قبل از اینکه در نهایت بمیرند تقسیم شوند و دیگر نمی توانند تقسیم شوند.
• تعداد تقسیم سلولی و طول عمر به تعدادی از عوامل مانند تفاوت‌های دودمان سلولی، گونه‌ها، شرایط کشت و محیط بستگی دارد.
• سلول های رده های سلولی محدود به عنوان سلول های چسبنده روی سطوح جامد رشد می کنند.

b- خطوط سلولی پیوسته

• رده های سلولی پیوسته سلول هایی هستند که رشد نامحدودی را از طریق سابکالچرهای بعدی نشان می دهند.
• سلول های رده های سلولی پیوسته سریعتر رشد می کنند تا یک کشت مستقل تشکیل دهند.
• سلول های رده های سلولی پیوسته نامیرا هستند و می توانند به طور نامحدود تقسیم شوند.
• سلول های موجود در رده های سلولی پیوسته می توانند از طریق تغییرات ژنتیکی تبدیل شوند و همچنین تومورزا هستند.
• سلول های تبدیل شده از کشت های سلولی اولیه طبیعی پس از درمان با مواد سرطان زا شیمیایی یا عفونت با ویروس های انکوژن تشکیل می شوند.
• سلول ها قادر به رشد برای تهیه تراکم سلولی بالاتر هستند و می توانند به صورت سوسپانسیون روی محیط های مایع رشد کنند.
• این سلول‌ها حتی می‌توانند روی هم رشد کنند و ساختارهای چندلایه‌ای روی رگ‌های کشت ایجاد کنند.

نمونه هایی از خطوط سلولی رایج

موارد زیر برخی از نمونه‌های رایج خطوط سلولی هستند.

آ. خط سلولی HeLa

سلول‌های HeLa یکی از اولین رده‌های سلولی انسان با کشت مداوم با کمک سلول‌های سرطان دهانه رحم هستند.
این سلول ها برای فرآیندهایی مانند کشت ویروس و ارزیابی دارویی پیش بالینی استفاده می شوند.

ب HL 60 (لوسمی)

ج MCF-7 (سلول های سرطان سینه)

روش یا پروتکل کشت سلولی حیوانی

1- شرایط رشد

• کشت سلول جانوری مستلزم استفاده از محیط های کشت خاص است که پیچیده تر و اختصاصی تر از محیط های کشت پایه برای رشد میکروبی است.
• برخی از اجزای اساسی مهم محیط کشت عبارتند از:
• نمک های معدنی، منبع نیتروژن، منبع انرژی، ویتامین ها، چربی و ویتامین های محلول در چربی، فاکتورهای رشد و هورمون ها.
• در برخی موارد، سیستم های بافر pH و آنتی بیوتیک ها نیز اضافه می شود.
• دمای رشد به منبع سلول بستگی دارد زیرا موجودات مختلف برای رشد و تقسیم سلولی به دماهای متفاوتی نیاز دارند.
• سلول های حیوانات خونگرم را می توان در دمای 37 درجه سانتیگراد به عنوان دمای مطلوب کشت داد،
• در حالی که سلول های حیوانات خونسرد را می توان بین 15 تا 25 درجه سانتیگراد کشت داد.

2- کشت سلولی اولیه

• کشت های سلولی اولیه از بافت های تازه ای که با کمک تیغ آسپتیک از اندام ها خارج می شوند، به دست می آیند.
• در برخی موارد، سلول ها با استفاده از تجزیه کننده های شیمیایی یا آنزیم های پروتئولیتیک حذف می شوند.
• سوسپانسیون سلولی به دست آمده با مایع بافر شسته می شود تا آنزیم های پروتئولیتیک حذف شوند.
• سوسپانسیون سلولی بر روی یک سطح صاف که می تواند یک ظرف کشت یا یک صفحه پتری استریل باشد، ریخته می شود.
• سلول هایی که می توانند به پایه ظرف بچسبند با یک محیط کشت مناسب پوشانده شده و در دمای اتاق انکوبه می شوند.

3- ذوب سلولی

• در مورد زیر کشت های بعدی، ممکن است از کشت سلولی حفظ شده استفاده شود.
• حمام آب تا دمای 37 درجه سانتیگراد گرم می شود و محیط رشد که در آن سلول ها قرار است پوشش داده شوند گرم می شود.
• محیط گرم به ظرف کشت اضافه می شود. سپس ویال حاوی سلول های یخ زده در حمام آب قرار می گیرد تا ذوب شود.
• پس از ذوب، و یا با الکل 70 درصد از بیرون شسته می شود.
• سوسپانسیون سلولی به داخل ظرف کشت سلولی ریخته می شود و به آرامی می چرخد تا همه چیز مخلوط شود.
• سپس محیط در یک شب تحت شرایط رشد معمولی انکوبه می شود. روز بعد محیط رشد جایگزین می شود.

4- سلول های تریپسین کننده

• تریپسینیزاسیون روش جداسازی سلول های چسبنده از سطح ظرف کشت با کمک آنزیم های پروتئولیتیک است.
• مرحله بالا زمانی انجام می شود که سلول ها برای عبور، شمارش یا اهداف دیگر مورد استفاده قرار گیرند.
• محیط برداشته می شود و سلول ها بازیابی می شوند. سپس سلول ها با بافر فسفات شسته می شوند.
• تریپسین-EDTA گرم به ظرف اضافه می شود تا تک لایه را بپوشاند.
• ظرف را می توان تکان داد تا اطمینان حاصل شود که تک لایه پوشش داده شده است.
• ظرف در انکوباتور CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1-3 دقیقه انکوبه می شود.
• ظرف از انکوباتور خارج می شود و فلاسک محکم با کف دست به کناره ضربه می زند تا به جدا شدن کمک کند.
• هنگامی که سلول ها جابجا شدند، در محیط رشد مناسب حاوی مقداری سرم مجدداً معلق می شوند.
• سپس سلول ها با کمک سوزن های سرنگ با برهم زدن توده های سلولی از هم جدا می شوند و بر اساس آن مورد استفاده قرار می گیرند.

کاربردهای کشت سلولی حیوانی

آ. تولید واکسن

• کشت سلول جانوری تکنیک مهمی است که برای توسعه تولید واکسن ویروسی استفاده می شود.
• این تکنیک برای ساخت واکسن نوترکیب علیه هپاتیت B و ویروس فلج اطفال استفاده شده است.
• رده های سلولی جاودانه برای تولید واکسن های ویروسی در مقیاس بزرگ یا صنعتی استفاده می شود.

ب. پروتئین های نوترکیب

• از کشت سلول جانوری نیز می توان برای تولید:

پروتئین های درمانی نوترکیب مانند سیتوکین ها، فاکتورهای رشد خونساز، فاکتورهای رشد، هورمون ها، فرآورده های خونی و آنزیم ها استفاده کرد.

• برخی از رده های سلولی رایج حیوانی که برای تولید این پروتئین ها استفاده می شوند، کلیه بچه هامستر و سلول های CHO هستند.

ج. ژن درمانی

• توسعه کشت سلول جانوری برای پیشرفت در ژن درمانی بسیار مهم است.
• سلول های دارای ژن معیوب را می توان با یک ژن عملکردی جایگزین کرد تا این گونه نقایص و بیماری ها برطرف شود.

د. سیستم های مدل

• سلول‌های به‌دست‌آمده از کشت سلولی را می‌توان به‌عنوان یک سیستم مدل برای مطالعات مربوط به زیست‌شناسی سلولی، برهم‌کنش‌های میزبان و پاتوژن، اثرات داروها و اثرات ناشی از تغییرات در ترکیب سلولی مورد مطالعه قرار داد.

ه. تحقیق سرطان

• از کشت سلول های حیوانی می توان برای بررسی تفاوت های سلول های سرطانی و سلول های طبیعی استفاده کرد زیرا سلول های سرطانی نیز می توانند کشت شوند.
• تفاوت ها اجازه می دهد تا مطالعات دقیق تری در مورد علل و اثرات بالقوه مواد سرطان زا مختلف انجام شود.
• سلول‌های طبیعی را می‌توان برای تشکیل سلول‌های سرطانی با استفاده از برخی مواد شیمیایی، ویروس‌ها و تشعشعات کشت داد.
• سلول های سرطانی همچنین می توانند به عنوان سیستم های آزمایشی برای مطالعات مربوط به کارایی داروها و تکنیک های مورد استفاده در درمان سرطان استفاده شوند.

ی. تولید سموم زیستی

• رده های سلولی حیوانی مانند Sf21 و Sf9 به دلیل سرعت رشد سریعتر و تراکم سلولی بالاتر می توانند برای تولید آفت کش های زیستی استفاده شوند.
• ارگانیسم هایی مانند باکولوویروس را می توان از طریق کشت سلولی حیوانی نیز تولید کرد.

مزایای کشت سلولی حیوانی

معایب کشت سلولی حیوانی

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.