کشت خطی باکتری
کشت خطی باکتری در میکروبیولوژی، تکنیکی است که برای جداسازی یک سویه خالص از یک گونه میکروارگانیسم، اغلب باکتری، استفاده می‌شود. رقت کردن یا جداسازی با روش کشت خطی برای اولین بار توسط لوفلر و گافکی در آزمایشگاه کخ ایجاد شد، که شامل رقیق‌سازی باکتری‌ها با کشت سیستماتیک آن‌ها در قسمت بیرونی آگار در یک ظرف پتری است تا کلنی‌های جدا شده به دست آید که سپس به تعداد زیادی رشد می‌کنند. کشت خطی سریع و ایده آل یک فرآیند ساده رقیق سازی است. این تکنیک با رقیق کردن غلظت نسبتاً زیاد باکتری به غلظت کمتر انجام می شود. کاهش باکتری ها باید نشان دهد که کلنی ها به اندازه کافی از هم جدا شده اند تا بر جداسازی انواع مختلف میکروب ها تأثیر بگذارند. کشت خطی با استفاده از یک ابزار استریل، مانند یک سواب پنبه ای یا معمولاً یک لوپ انجام می شود.
از تکنیک های آسپتیک برای حفظ کشت های میکروبیولوژیکی و جلوگیری از آلودگی محیط رشد استفاده می شود.
اصول کشت خطی باکتری
روش کشت خطی یک روش جداسازی کیفی سریع است. تکنیک‌هایی که معمولاً برای جداسازی کلنی‌های مجزا مورد استفاده قرار می‌گیرند در ابتدا نیازمند کاهش تعداد ارگانیسم‌ها در تلقیح‌ها هستند. این در اصل یک تکنیک رقیق سازی است که شامل پخش یک لوپ از کشت بر روی سطح یک صفحه آگار است. در نتیجه اندازه کاهش جمعیت تضمین می کند که پس از تلقیح، سلول های منفرد به اندازه کافی در سطح محیط آگار از هم فاصله داشته باشند تا گونه های مختلف موجود را جدا کنند.
در این روش،
از یک حلقه یا سواب استریل برای به دست آوردن یک کشت میکروبی غیر آلوده استفاده می شود.
این فرآیند زمانی که از یک صفحه آگار با کلنی های جدا شده انجام می شود و با استفاده از یک لوپ یا سوزن استریل به یک صفحه آگار یا ژلاتین جدید منتقل می شود، “چیدن کلونی ها” ( picking colonies ) نامیده می شود. سپس لوپ یا سوزن تلقیح بر روی سطح آگار خط زده می‌شود. در ناحیه اولیه کشت، بسیاری از میکروارگانیسم‌ها رسوب می‌کنند که منجر به رشد هم‌آهنگ یا رشد کشت در کل سطح ناحیه رگه‌شده می‌شود. لوپ با گرم شدن در شعله آبی مشعل، بین بخش‌ها یا مناطق مختلف، استریل می‌شود و در نتیجه میکروارگانیسم‌های کمتری با پیشرفت کشت رسوب می‌کنند.
فرآیند کشت خطی نمونه ای را که در ناحیه اولیه سطح آگار قرار داده شده است رقیق می کند.
روش های کشت خطی
- T-Streak method ( سه مرحله ای )
- quadrant method (چهار مرحله ای )
- continuous method ( پیوسته )
- Radiant method ( شعاعی )
1- T-Streak method
الگوی خطی سه فازی به نام T-Streak ( three-phase streaking ) شناخته می شود. کشت دادن با استفاده از یک ابزار استریل، مانند یک سواب پنبه ای یا معمولاً یک لوپ تلقیح انجام می شود.
مراحل
لوپ تلقیح ابتدا با عبور دادن از داخل شعله استریل می شود.
هنگامی که لوپ خنک شد، آن را در یک محیط تلقیح مانند براث یا نمونه بیمار حاوی گونه های زیادی از باکتری ها فرو می برند. سپس لوپ تلقیح در سطح آگار با حرکت زیگزاگ به جلو و عقب کشیده می شود تا زمانی که تقریباً 30 درصد صفحه پوشانده شود. سپس لوپ مجدداً استریل می شود و صفحه 90 درجه می چرخد. با شروع از قسمت رگه‌شده قبلی، لوپ دو تا سه بار از طریق آن کشیده می‌شود و الگوی زیگزاگ را ادامه می‌دهد. سپس این روش یک بار دیگر تکرار می‌شود و مراقب باشید که بخش‌های رگه‌شده قبلی را لمس نکنید. هر بار لوپ کمتر و کمتر باکتری را جمع آوری می کند تا زمانی که تنها سلول های باکتریایی را جمع کند که می توانند به یک کلنی تبدیل شوند. صفحه باید بیشترین رشد را در بخش اول نشان دهد.
بخش دوم دارای رشد کمتر و تعداد کمی کلنی ایزوله خواهد بود، در حالی که بخش نهایی دارای کمترین میزان رشد و تعداد زیادی کلنی جدا شده خواهد بود.
2- quadrant method
در روش ربع، چهار مقطع با اندازه مساوی کشت داده می‌شوند.
لوپ تلقیح را با قرار دادن در مشعل بونزن تا زمانی که داغ شود، استریل کنید. اجازه دهید تا خنک شود. یک کلنی جدا شده از کشت پلیت آگار انتخاب کنید و آن را روی ربع اول (تقریباً 1/4 صفحه) پخش کنید یا لوپ خود را در بطری لوله / کشت قرار دهید و مقداری تلقیح را بردارید. شما به یک تکه بزرگ نیاز ندارید. بلافاصله لوپ تلقیح را به آرامی روی یک چهارم صفحه با استفاده از یک حرکت رفت و برگشت به صورت خطی بکشید. لوپ را مجدداً شعله زده و اجازه دهید خنک شود. با بازگشت به لبه ناحیه 1 که به تازگی رگه زده اید، رگه ها را تا ربع دوم بشقاب گسترش دهید. این کار را برای مناطق 3 و 4 نیز انجام دهید. در نهایت یک بار دیگر لوپ خود را شعله ور کنید.
3- continuous Method
- لوپ را به کمک حرارت استریل کرده و آن‌را به کشت باکتریایی آغشته کنید.
- مطابق با شکل، با شروع از لبه پلیت (منطقه A) ارگانیسم‌ها را در یک حرکت مداوم به سمت مرکز پلیت گسترش دهید.
- دقت داشته باشید که فشار بیش از حد وارد نکرده و آگار را جدا نکنید.
- پلیت را ۱۸۰ درجه بچرخانید.
- بدون حرارت دادن لوپ، کشت خطی را از ناحیه B (سمت مخالف) شروع کرده و به سمت مرکز پلیت پیش بروید.
4- Radiant Method
- با استفاده از لوپ استریل شده، کشت باکتریایی را در ناحیه کوچک نزدیک لبه پلیت قرار دهید (منطقه ۱)
- لوپ را حرارت دهید و ۵ ثانیه صبر کنید تا خنک شود.
- از لبه منطقه ۱، به کمک لوپ ردیف‌های مستقیمی ایجاد کنید.
- لوپ را مجددا حرارت دهید و اجازه دهید خنک شود. سپس از روی آخرین خطوط افقی، خطوطی روی رگه‌های ایجاد شده بکشید.
اهمیت روش کشت خطی باکتری
تکنیک کشت خطی محبوب ترین روش برای جداسازی باکتری های خاص از نمونه حاوی مخلوطی از میکروارگانیسم ها است. از تکنیک کشت خطی برای رشد باکتری ها در سطح محیط رشد استفاده می شود تا کلنی های باکتریایی جدا شده و نمونه برداری شوند. سپس نمونه‌ها را می‌توان از کلنی‌های جدا شده به دست آورد و یک کشت میکروبیولوژیکی را می‌توان در یک صفحه جدید رشد داد تا ارگانیسم شناسایی، مطالعه یا آزمایش شود.
هنگامی که باکتری ها کشت و جدا می شوند، می توان عامل ایجاد کننده یک بیماری باکتریایی را شناسایی کرد.
محدودیت های Streak plate
کشت خطی یک روش آزمایشگاهی میکروبیولوژی است که دو عیب عمده دارد:
- اولاً، کاربران نمی توانند با استفاده از این روش، بی هوازی های اجباری را پرورش دهند.
- ثانیاً، فقط موجوداتی که در نمونه اصلی زنده بودند، می‌توانند رشد کنند.
نکات عمومی
1. اول برچسب بزنید، دوم کشت کنید.
به وضوح برچسب زدن پلیت های خود برای شناسایی میکروارگانیسم تنها چند ثانیه طول می کشد و به شما کمک می کند بعدا از گمراهی بزرگ جلوگیری کنید.
2. آگار را خشک نگه دارید.
مطمئن شوید که صفحات آگار عاری از قطرات رطوبت متراکم هستند. اگر رطوبت وجود دارد، منتظر بمانید تا صفحات خشک شوند.
3. از لبه پلیت اجتناب کنید.
تماس با لبه پلیت می تواند آلودگی هایی را به آگار وارد کند.
4. کمی راه طولانی را طی می کند.
فقط مقدار کمی تلقیح مورد نیاز است. در صورت گرفتن تلقیح از پلیت دیگر از کلنی های جدا شده استفاده کنید یا فقط از 5 تا 10 میکرولیتر از سوسپانسیون استفاده کنید.
5. خراب شدن آگار خوب نیست.
به آرامی با حرکات صاف و سریع کشت کنید تا از خراشیدن صفحه آگار جلوگیری کنید. آگار خراب شده کلنی تولید نمی کند (یا تقریباً به زیبایی یک پلیت به نظر نمی رسد).
6. استریل کردن را فراموش نکنید.
همیشه از تجهیزات استریل برای پخش تلقیح استفاده کنید. بعد از اینکه هر ربع را خط کشیدید، لوپ را روی شعله قرار دهید یا از یک لوپ یکبار مصرف جدید استفاده کنید. استفاده از یک لوپ جدید یا استریل شده به شما این امکان را می دهد که به طور موثر تلقیح روی پلیت را رقیق کنید و با پخش یکنواخت تر و نازک تر تلقیح، کلنی های جدا شده به دست آورید.
7. نفس خود را حبس کنید.
- صفحات باز را در فاصله ایمن از صورت خود مشاهده کنید.
- تنفس در بشقاب ها اشتباهی آشکار است.
- همه میکروبیولوژیست ها آموزش دیده از آن اجتناب کنند، اما هنوز هم یکی از علل شایع آلودگی در هر آزمایشگاهی است.
“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.
