کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا معمولاً به عنوان HPLC شناخته می شود، یک تکنیک تحلیلی است که برای جداسازی، شناسایی یا تعیین کمیت هر جزء در یک مخلوط استفاده می شود. مخلوط با استفاده از اصل اصلی کروماتوگرافی ستونی جدا می شود و سپس با طیف سنجی شناسایی و کمی سازی می شود. در دهه 1960، کروماتوگرافی ستونی LC با ستون‌های شیشه‌ای مناسب با فشار کم، بیشتر به HPLC با ستون‌های فلزی سازگار با فشار بالا توسعه یافت. بنابراین HPLC اساساً یک شکل بسیار بهبود یافته از کروماتوگرافی مایع ستونی است. به جای اینکه حلال تحت فشار گرانش از طریق ستون چکه کند، تحت فشارهای بالا تا 400 اتمسفر وارد می شود.

کروماتوگرافی فاز مایع با فشار بالا

اصل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

تصفیه در یک ستون جداسازی بین فاز ثابت (stationary phase) و متحرک (mobile phase) صورت می گیرد. فاز ساکن یک ماده دانه ای با ذرات متخلخل بسیار کوچک در یک ستون جداسازی است. فاز متحرک، از طرف دیگر، یک حلال یا مخلوط حلال است که در فشار بالا از طریق ستون جداسازی عبور می کند. از طریق یک دریچه با یک حلقه نمونه متصل، یعنی یک لوله کوچک یا یک مویرگی ساخته شده از فولاد ضد زنگ، نمونه با استفاده از یک سرنگ به جریان فاز متحرک از پمپ به ستون جداسازی تزریق می شود.

متعاقباً، اجزای منفرد نمونه با سرعت‌های متفاوتی از طریق ستون مهاجرت می‌کنند، زیرا به درجات متفاوتی توسط برهمکنش با فاز ساکن حفظ می‌شوند. پس از خروج از ستون، مواد منفرد توسط یک آشکارساز مناسب شناسایی شده و به عنوان سیگنال به نرم افزار HPLC روی کامپیوتر ارسال می شود. در پایان این عملیات، کروماتوگرام در نرم افزار HPLC روی کامپیوتر به دست می آید. کروماتوگرام امکان شناسایی و تعیین کمیت مواد مختلف را فراهم می کند.

ابزار دقیق کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

High-Performance-Liquid-Chromatography-HPLC

پمپ (The Pump)

توسعه HPLC منجر به توسعه سیستم پمپ شد. پمپ در بالاترین جریان سیستم کروماتوگرافی مایع قرار می گیرد و یک جریان شوینده از مخزن حلال به داخل سیستم تولید می کند. تولید فشار بالا یک نیاز «استاندارد» پمپ ها است که علاوه بر آن، باید بتواند فشار ثابتی را در هر شرایطی و نرخ جریان قابل کنترل و تکراری ارائه دهد. بیشتر پمپ های مورد استفاده در سیستم های LC فعلی جریان را با حرکت رفت و برگشت پیستون موتوری (پمپ های رفت و برگشتی) تولید می کنند. به دلیل این حرکت پیستون، “پالس” تولید می کند.

انژکتور (Injector)

یک انژکتور در کنار پمپ قرار می گیرد. ساده ترین روش استفاده از سرنگ است و نمونه با جریان شوینده آشنا می شود. پرکاربردترین روش تزریق بر اساس حلقه های نمونه برداری است. استفاده از سیستم نمونه گیری خودکار (انژکتور خودکار) نیز به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد که امکان تزریق های مکرر را در یک زمان بندی زمان بندی شده تنظیم می کند.

انژکتور (Injector) در واقع نقش تزریق کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگراف مایع بازی می کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که می تواند بین پمپ و ستون قرار گرفته و بتواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید. مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای با حجم مشخص به نام لوپ در کمین نشسته تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه داده شده کاربر به داخل حلال تزریق نماید.

ستون (Column)

  • جداسازی در داخل ستون انجام می شود. ستون های اخیر اغلب به جای ستون های شیشه ای در یک محفظه فولادی ضد زنگ تهیه می شوند.
  • مواد بسته بندی که به طور کلی استفاده می شود سیلیس یا ژل های پلیمری در مقایسه با کربنات کلسیم است.
  • شوینده مورد استفاده برای LC از حلال اسیدی تا حلال بازی متفاوت است.
  • بیشتر محفظه ستون ها از فولاد ضد زنگ ساخته شده است زیرا ضد زنگ نسبت به انواع زیادی از حلال ها متحمل است.

آشکارساز (Detector)

دتکتور دستگاهی است که بنابر خاصیتی مثل میزان جذب می تواند غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع بسنجد، در بیشتر موارد دتکتور کروماتوگراف یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در طول موج خاصی می تواند مقدار و نوع نمونه را نمایش دهد و این دتکتور SPD نامیده می شود. از دیگر دتکتور های کروماتوگراف می توان از دتکتور RID نام برد که بر اساس ضریب شکست نمونه آن را شناسائی و مقدارسنجی می نماید. دتکتور RF، براساس میزان فلورسانس نمونه. دتکتور MS براساس جرم مولکولی.

گازگیر (Degasser)

شوینده مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل LC ممکن است حاوی گازهایی مانند اکسیژن باشد که برای چشم ما قابل مشاهده نیست. هنگامی که گاز در شوینده وجود دارد، این به عنوان نویز تشخیص داده می شود و باعث ایجاد خط پایه ناپایدار می شود. گاز زدا از لوله های غشایی پلیمری مخصوص برای حذف گازها استفاده می کند. منافذ بسیار کوچک روی سطح لوله پلیمری به هوا اجازه عبور می دهد و در عین حال از عبور مایع از منافذ جلوگیری می کند.

بخاری ستونی (Column Heater)

جداسازی LC اغلب تا حد زیادی تحت تأثیر دمای ستون است. برای به دست آوردن نتایج قابل تکرار، حفظ شرایط دمایی ثابت مهم است. همچنین برای برخی از تجزیه و تحلیل ها، مانند قند و اسید آلی، وضوح بهتری را می توان در دماهای بالا (50 تا 80 درجه سانتی گراد) به دست آورد. بنابراین ستون ها به طور کلی در داخل کوره ستونی (هیتر ستونی) نگهداری می شوند.

high-performance-liquid-chromatography-hplc-instrumentation-principle

انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

Describes-the-types-Branches-of-Chromatography-hplc-min

فاز عادی (Normal phase):

بسته بندی ستون قطبی است (به عنوان مثال سیلیس) و فاز متحرک غیر قطبی است.

برای ترکیبات حساس به آب، ایزومرهای هندسی، ایزومرهای سیس ترانس و ترکیبات کایرال استفاده می شود.

فاز معکوس (Reverse phase):

بسته بندی ستون غیر قطبی است (به عنوان مثال C18)، فاز متحرک آب + حلال قابل امتزاج (مانند متانول) است.

می توان از آن برای نمونه های قطبی، غیر قطبی، یونیزه پذیر و یونی استفاده کرد.

تبادل یونی (Ion exchange):

بسته بندی ستون شامل گروه های یونی است و فاز متحرک بافر است. برای جداسازی آنیون ها و کاتیون ها استفاده می شود.

حذف اندازه (Size exclusion):

مولکول ها در منافذ یک محیط متخلخل منتشر می شوند و بر اساس اندازه نسبی آنها به اندازه منافذ جدا می شوند. مولکول های بزرگ ابتدا و مولکول های کوچکتر بعداً شستشو می شوند.

کاربردهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

HPLC به روشی جهانی تبدیل شده است که تقریباً در تمام زمینه های شیمی، بیوشیمی و داروسازی کاربرد دارد.

  • تجزیه و تحلیل داروها
  • تجزیه و تحلیل پلیمرهای مصنوعی
  • تجزیه و تحلیل آلاینده ها در تجزیه و تحلیل زیست محیطی
  • تعیین داروها در ماتریس های بیولوژیکی
  • جداسازی محصولات با ارزش
  • خلوص محصول و کنترل کیفیت محصولات صنعتی و مواد شیمیایی خوب
  • جداسازی و خالص سازی پلیمرهای زیستی مانند آنزیم ها یا اسیدهای نوکلئیک
  • تصفیه آب
  • پیش تغلیظ اجزای کم مصرف
  • کروماتوگرافی تبادل لیگاند (Ligand-exchange chromatography)
  • کروماتوگرافی تبادل یونی پروتئین ها (Ion-exchange chromatography of proteins)
  • کروماتوگرافی تبادل آنیونی با pH بالا کربوهیدرات ها و الیگوساکاریدها

مزایای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

  1. سرعت
  2. بهره وری
  3. دقت
  4. همه کاره و بسیار دقیق برای شناسایی و تعیین کمیت اجزای شیمیایی.

محدودیت ها

  1. هزینه: با وجود مزایایی که دارد، HPLC می تواند گران باشد و به مقادیر زیادی مواد آلی گران قیمت نیاز دارد.
  2. پیچیدگی
  3. حساسیت پایین: HPLC نسبت به برخی ترکیبات حساسیت کمی دارد و برخی از آنها را نمی توان تشخیص داد زیرا به طور برگشت ناپذیر جذب می شوند.
  4. مواد فرار با کروماتوگرافی گازی بهتر جدا می شوند.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.