پروتئیناز کا

پروتئیناز کا یک آنزیم پروتئولیتیک با طیف وسیع و غیر اختصاصی است که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی برای غیرفعال کردن آلاینده های پروتئینی در نمونه های آماده استفاده می شود. این اندوپپتیداز در محدوده وسیعی از pH، بهینه بین 6.5 تا 9.5، و دماهای نسبتا بالا، بهینه 50-65 درجه سانتیگراد، فعال باقی می ماند.

این پروتئین بسیار مقاوم است، در حضور نمک های آشفته، مواد شوینده و در دماهای بالا به عملکرد خود ادامه می دهد و یک روش کارآمد و قابل اعتماد برای بیشتر کاربردها ارائه می دهد.

پروتئیناز K که به نام پروتئاز K نیز شناخته می‌شود، توسط Tritirachium album Limber ترشح می‌شود، اگر این کپک در حضور کراتین رشد کند، بنابراین به عنوان تنها منبع نیتروژن، “K” نامیده می‌شود.

پروتئیناز K = پروتئین (زنجیره بلند اسیدهای آمینه) + آز (پسوند آنزیم) + K (کراتین)

فعالیت

پروتئازها آنزیم هایی هستند که تجزیه پروتئین را به اسیدهای آمینه کاتالیز می کنند، پروتئیناز کا یک پروتئاز سرین با طیف گسترده ای است که متعلق به کلاس سوبتیلیسین است (دو نوع پروتئاز سرین وجود دارد، کیموتریپسین و سوبتیلیسین). این آنزیم از خانواده پپتیدازهای S8 است. محل غالب برش، پیوند پپتیدی مجاور گروه کربوکسیل اسیدهای آمینه آلیفاتیک و آروماتیک با گروه های آلفا آمینه مسدود شده است.

یون کلسیم کوفاکتور آنزیم پروتئیناز K است، یون‌های کلسیم بر فعالیت آنزیم تأثیر نمی‌گذارند، اما به پایداری آن کمک می‌کنند (پایداری حرارتی و محافظت از پروتئیناز K در برابر اتولیز)، اگر یون‌های کلسیم حذف شوند (مثلاً با استفاده از EDTA)، پایداری آنزیم کاهش می یابد، اما فعالیت پروتئولیتیک حفظ می شود.

هضم پروتئیناز کا برای خالص سازی اسید نوکلئیک معمولاً در حضور EDTA (که برای مهار آنزیم های وابسته به یون فلزی مانند نوکلئازها ضروری است) انجام می شود. EDTA تأثیر مستقیمی بر فعالیت آنزیم پروتئیناز K ندارد، می تواند بر کلسیم تأثیر بگذارد و در نتیجه فعالیت پروتئیناز K را تا حدی کاهش دهد.

پروتئیناز K و RNaseها معمولاً در بافر لیز با هم اضافه می شوند زیرا ترکیب کارآمدی را تشکیل می دهند. RNase آر ان آ (RNA) آلوده را تجزیه می کند و پروتئین K پروتئین ها، DNase ها و RNase های آسیب دیده را تجزیه می کند.

پایداری پروتئیناز K

پروتئیناز K در محدوده وسیعی از pH (از 4 تا 12) و دما (از 37+ تا 65+ درجه سانتی گراد) پایدار است. افزایش دمای واکنش از 37 درجه سانتی‌گراد به 50 تا 60 درجه سانتی‌گراد، می‌تواند فعالیت را چندین برابر افزایش دهد، با در دسترس‌تر کردن محل‌های برش آن، مانند افزودن 0.5 تا 1 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) یا کلرید گوانیدینیم (3 مولار)، گوانیدینیم تیوسیانات (1 مولار) و اوره (4 مولار).

پروتئیناز K برای چه مواردی استفاده می شود؟

◉ پروتئیناز K معمولاً در زیست‌شناسی مولکولی برای هضم پروتئین‌ها، حذف آلودگی‌ها و غیرفعال کردن DNaseها و RNase‌ها استفاده می‌شود که در غیر این صورت یک نمونه DNA یا RNA مورد نظر را تجزیه می‌کنند. پروتئیناز k برای این کاربرد مناسب است زیرا آنزیم در حضور مواد شیمیایی دناتوره کننده پروتئین مانند SDS و اوره، عوامل کیلیت کننده مانند EDTA، معرف های سولفید هیدروژن و تریپسین یا مهارکننده های کیموتریپسین فعال است.

◉ برای تخریب پروتئین ها در لیزات سلولی (بافت ها، سلول های کشت سلولی) و برای آزادسازی اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود.

◉ پروتئيناز K براي مشخص كردن پروتئين ها نيز مفيد است: با توجه به ويژگي برش پروتئيناز K، قطعات مشخصي از پروتئين ها به دست مي آيد كه براي تعيين ساختار و عملكرد پروتئين ها مفيد هستند.

◉ پروتئیناز کا در جداسازی DNA یا RNA بسیار بومی و سالم بسیار مفید است، زیرا اکثر DNaseها و RNaseهای میکروبی یا پستانداران به سرعت توسط آنزیم غیرفعال می شوند، به ویژه در حضور 0.5 در SDS 1٪.

چگونه پروتئیناز K را غیر فعال می کنید؟

پروتئیناز K با حرارت دادن در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه غیرفعال می شود (حرارت دادن پروتئیناز K آنزیم را به طور کامل غیرفعال نمی کند، همیشه مقدار کمی از فعالیت از طریق این روش باقی می ماند.)، اسید تری کلرواستیک (TCA) یا مهارکننده های پروتئاز سرین AEBSF ،PMSF یا DFP (پروتئیناز K را به طور دائم غیرفعال می کند)

وظیفه پروتئیناز k در استخراج DNA چیست؟

1. در طول استخراج DNA (یا اسیدهای نوکلئیک به طور کلی)، بسیاری از پروتئین های آلوده وجود دارند. پروتئیناز K در بسیاری از پروتکل های استخراج DNA برای هضم این پروتئین های آلوده استفاده می شود.
2. علاوه بر این، نوکلئازها (آنزیم هایی که اسیدهای نوکلئیک را تجزیه می کنند) ممکن است وجود داشته باشند، افزودن پروتئیناز کا این نوکلئازها را تجزیه می کند و از اسیدهای نوکلئیک در برابر حمله نوکلئاز محافظت می کند.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.