شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاه
ویروس کرونا که در سـال 2019 ظهور و همه گیر شـد می‌تواند عامل‌ذات‌الریه، تنگی‌نفس مرگ در انسـان شـود. این ویـروس از خانواده کرونا‌ویریده، جنس بتاکروناویروس‌ها بـوده که دارای RNA تک رشـته سـنس مثبت می‌باشد. سـاختار ذره ویروس تقریبا‌ً کروی شکل با قطر 60 تا 140 نانومتر است که دارای میخک های تاجی شبیه به خورشید(کرونا) است.
ژنوم کرونا ویروس، RNA است که بصورت مارپیچ و یا حلقوی در نوکلئوکپسید ویروس رویت میشود که یک رشته منفرد از RNA مثبت (ریبونوکلئیک اسید) است. RNA این ویروس در ناحیه’5، کلاهک متیله شده دارد و در انتهای ’3 خود سرشار از نوکلئوتید آدنین است.
این ویروس بوسیله ژنوم خود آنزیم ریپلیکاز که نوعی پروتئین است را کدنویسی میکند که نتیجه آن تولید نسخه های جدید با شرایط سلول میزبان است. با ورود ویروس به سلول میزبان، ژنوم ویروس کپی و ویروس شروع به تکثیر میشود. گاهی در این روند اشتباهاتی رخ میدهد که منجر به تغییر RNA میشود. این تغییرات در اصطلاح جهش نامیده میشوند. این جهش ها کاملاً تصادفی و اتفاقی هستند که باعث تغییر در ویروس کرونا میشوند و این روند طبیعی کپی و تکثیر ویروس است.
شناسایی ویروس کرونا
شناسایی ویروس کرونا با آزمایش ریل تایم پی سی آر (Real Time-qPCR)، جهت تشخیص ویروس کرونا (SARS-CoV-2) یا کووید ۱۹ انجام می‌گیرد. با استفاده از آزمایش RT-PCR ماده ژنتیکی ویروس کووید ۱۹ که RNA نامیده میشود، در نمونه‌های دستگاه تنفسی (مانند بینی و حلق) شناسایی میشود. بر اساس نتایج این روش می‌توان اطلاعات دقیقی از تعداد ویروس کووید ۱۹ موجود در نمونه‌های گرفته شده از بیمار بدست آورد. به این دلیل نتایج حاصل از RT-PCR در تشخیص عفونت فعال کووید ۱۹ و ارزیابی شدت بیماری کرونا قابل اعتماد می‌باشند.
آزمایش مولکولی کرونا به روش RT-qPCR تنها روش تشخیص قطعی این بیماری می‌باشد. در این روش از طریق استخراج و شناسایی ماده ژنتیکی ویروس (RNA)، حضور و تعداد ویروس در نمونه‌های گرفته شده از مجاری تنفسی فوقانی و تحتانی بیماران مشکوک مبتلا به کووید ۱۹ مشخص می‌گردد.
یک آزمایشگاه برای تشخیص نهایی کرونا ویروس باید دو تکنیک را انجام دهد که هر کدام از این دو مرحله به روش های مختلفی انجام می شود.
- استخراج ژنوم SARS-CoV-2
- شناسایی ژنوم SARS-CoV-2
استخراج ژنوم SARS-CoV-2
روش های استخراج RNA از نظر ماهیت شبیه استخراج DNA هستند، با این تفاوت که محصول نهایی استخراج نباید شامل عوامل واسرشته کننده مانند EDTA ،SDS، نمک، یون های کلراید، پلی ساکارید و نوکلئازهای فعال باشد. می توان از کیت های تجاری یا روش های دستی مثل پروتکل ترایزول (فنل باعث تخریب سلول و پروتئین و گوانیدیوم ایزوتیوسیانات باعث حل کردن پوشش سلولی و مهار RNase می شود) یا روش فنول/کلروفرم/ایزوآمیل الکل برای استخراج ماده ژنتیکی ویروس کرونا (RNA) استفاده کرد. روش اولتراسانتریفیوژ در شیب کلرید سدیم، رسوب در کلرید لیتیم و رسوب در استات آمونیوم نیز برای استخراج RNA مورد استفاده قرار می گیرد.
نکات کلیدی در استخراج RNA
- قابل توجه است که RNaseهای اگزوژن که RNA را تهدید می کنند، به طور گسترده در محیط و دست انسان وجود دارد. این آنزیم به حرارت 120 درجه سانتیگراد و اتوکلاو به مدت 15 دقیقه مقاوم می باشد و برای از بین بردن آن نیاز به دمای خشک 180 الی 200 درجه سانتیگراد به مدت 6 ساعت می باشد.
- حتما در طول فرایند استخراج RNA دستکش بپوشید، دقت داشته باشید که وسایل مورد استفاده فاقد RNase باشند. می توان از DEPC یک دهم درصد برای غیرفعال کردن RNase لوازم چندبار مصرف استفاده کرد. این ماده با تغییر کوالانسی هیستیدین، لیزین، سیستئین و تیروزین باعث مهار RNase می شود، سپس با اتوکلاو کردن وسایل در دمای 180 درجه سانتیگراد، DEPC را غیرفعال کنید.
- از DEPC در وسایلی مثل تانک الکتروفورز استفاده نکنید، چون باعث تخریب این وسایل می شود. برای غیرفعال کردن RNsae در این چنین مواد پلی استیرن یا پلی کربنی می توانید با قرار دادن 10 دقیقه ای وسیله در محلول 10 درصد پراکسید هیدروژن، سپس تیمار و شستشو در آب RNase free این کار را انجام دهید. توجه شود که DEPC treated water مهارکننده واکنش PCR می باشد.
- می توانید از محلول های تجاری از بین بردن RNase مانند RNase away , RNase erase استفاده کنید. برای مهار RNase اندورژن نیز می توانید از RNase OUT استفاده کنید. برای حداقل رساندن DNA ای که در زمان استخراج ماده ژنتیکی ویروس کرونا (RNA) نیز جدا می شود و برای جلوگیری از اتصالات کاذب (زمانی که پرایمر ما شامل نواحی اتصالی اگزون نیست، یا ژن موردنظر دارای توالی اگزون نمی باشد و یا وجود سودوژن ها) به DNA، استفاده از DNase I توصیه می شود.
جهت مطالعه مرحله دوم شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاه کلیک کنید.
