ریل تایم PCR : اصل، فرآیند، نشانگرها، مزایا و موارد استفاده

ریل تایم PCR تکنیکی است که برای نظارت بر پیشرفت واکنش PCR در زمان واقعی استفاده می شود. در همان زمان، مقدار نسبتاً کمی از محصول PCR (DNA، cDNA یا RNA) را می توان کمی سازی کرد. این تکنیک بر اساس تشخیص فلورسانس تولید شده توسط یک مولکول گزارشگر (پروب) است که با ادامه واکنش افزایش می یابد.

همچنین به عنوان یک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (qPCR) شناخته می شود، که یک روش آزمایشگاهی زیست شناسی مولکولی بر اساس واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است. qPCR یک تکنیک قدرتمند است که امکان تقویت نمایی توالی های DNA را فراهم می کند. یک واکنش PCR به یک جفت پرایمر نیاز دارد که مکمل توالی مورد نظر باشد. پرایمرها توسط DNA پلیمراز گسترش می یابند. نسخه های تولید شده پس از گسترش، به اصطلاح آمپلیکون ها، با همان آغازگرها دوباره تکثیر می شوند که در نتیجه منجر به تقویت نمایی مولکول های DNA می شود.

با این حال، پس از تقویت، از الکتروفورز ژل برای تجزیه و تحلیل محصولات PCR تقویت شده استفاده می شود و این امر باعث می شود PCR معمولی وقت گیر باشد. اصطلاح “زمان واقعی” نشان می دهد که می تواند پیشرفت تقویت را هنگامی که فرآیند در حال انجام است نظارت کند، برخلاف روش PCR معمولی که تجزیه و تحلیل تنها پس از تکمیل فرآیند امکان پذیر است.

اصطلاحات PCR

PCRPolymerase chain reaction
RT-PCRReverse transcription-polymerase chain reaction
qPCRReal-time polymerase chain reaction
qRT-PCRRT-PCR / qPCR combined technique
Real time pcr

اصول ریل تایم PCR

همین اصل تقویت PCR در ریل تایم PCR استفاده می شود. اما به جای نگاه کردن به نوارهای روی یک ژل در پایان واکنش، فرآیند در “زمان واقعی” نظارت می شود. واکنش در یک دستگاه PCR بلادرنگ قرار می گیرد که با دوربین یا آشکارساز واکنش را مشاهده می کند.

اگرچه بسیاری از تکنیک های مختلف برای نظارت بر پیشرفت واکنش PCR استفاده می شود، اما همه یک چیز مشترک دارند. همه آنها تقویت DNA را به تولید فلورسانس مرتبط می کنند که به سادگی با دوربین در طول هر چرخه PCR قابل تشخیص است. از این رو، با افزایش تعداد نسخه های ژن در طول واکنش، فلورسانس نیز افزایش می یابد که نشان دهنده پیشرفت واکنش است.

مراحل Real Time PCR (پروتکل)

روند کار را می توان به دو مرحله تقسیم کرد:

الف. تقویت (Amplification)

دناتوره سازی
انکوباسیون در دمای بالا برای “ذوب” DNA دو رشته ای به تک رشته ها و سست کردن ساختار ثانویه در DNA تک رشته ای استفاده می شود. بالاترین دمایی که DNA پلیمراز می تواند تحمل کند معمولاً استفاده می شود (معمولاً 95 درجه سانتیگراد). اگر محتوای GC الگو زیاد باشد، زمان دناتوره شدن را می توان افزایش داد.

آنیل کردن
در طول آنلینگ، توالی های مکمل فرصت هیبرید شدن دارند، بنابراین از دمای مناسبی استفاده می شود که بر اساس دمای ذوب محاسبه شده (Tm) پرایمرها (5 درجه سانتی گراد زیر Tm پرایمر) باشد.

گسترش
در دمای 70-72 درجه سانتی گراد، فعالیت DNA پلیمراز بهینه است و گسترش پرایمر تا سرعت 100 باز در ثانیه رخ می دهد. هنگامی که یک آمپلیکون در ریل تایم PCR کوچک است، این مرحله اغلب با مرحله آنیلینگ با استفاده از 60 درجه سانتیگراد به عنوان دما ترکیب می شود.

ب. تشخیص

تشخیص مبتنی بر فناوری فلورسانس است. نمونه ابتدا در جای مناسب نگهداری می شود و مانند PCR معمولی تحت سیکل حرارتی قرار می گیرد.

با این حال، دستگاه در ریل تایم PCR در معرض تنگستن یا منبع هالوژن قرار می گیرد که منجر به فلورسانس نشانگر اضافه شده به نمونه می شود و سیگنال با تقویت تعداد کپی DNA نمونه تقویت می شود.

سیگنال ساطع شده توسط یک آشکارساز شناسایی شده و پس از تبدیل به سیگنال دیجیتالی که روی صفحه نمایش داده می شود به کامپیوتر ارسال می شود. هنگامی که سیگنال به سطح آستانه -threshold level- (پایین ترین سطح تشخیص آشکارساز) می رسد، قابل تشخیص است.

نشانگرهای فلورسانس مورد استفاده در ریل تایم PCR

مارکرهای مختلفی در Real Time PCR استفاده می شود اما رایج ترین آنها عبارتند از:

  • Taqman probe
  • SYBR Green

Taqman probe

این یک پروب هیدرولیز است که حاوی یک رنگ گزارشگر، اغلب فلورسئین (FAM) در انتهای 5 پریم و یک خاموش کننده تترامتیل رودامین (TAMRA) است که به انتهای 3 پریم این الیگونوکلئوتید متصل است.

در شرایط عادی، پروب روی خودش پیچ خورده باقی می ماند و رنگ فلورسانس را به خاموش کننده نزدیک می کند، که سیگنال فلورسنت رنگ را مهار یا خاموش می کند.

الیگونوکلئوتید Taq polymerase دارای ناحیه همولوگ با ژن هدف است و بنابراین هنگامی که توالی هدف در مخلوط وجود دارد، با DNA نمونه متصل می شود.

همانطور که Taq پلیمراز شروع به سنتز رشته DNA جدید در مرحله گسترش می کند، باعث تخریب پروب توسط فعالیت هسته 5′ انتهایی می شود و فلورسین از خاموش کننده جدا می شود و در نتیجه سیگنال فلورسانس تولید می شود.

با ادامه این روش، در هر چرخه تعداد مولکول های سیگنال افزایش می یابد و باعث افزایش فلورسانس می شود که به طور مثبت با تقویت هدف مرتبط است.

SYBR Green

این رنگی است که سیگنال فلورسنت برجسته ای را منتشر می کند که به طور غیر اختصاصی به شیار کوچک DNA متصل می شود.

سایر رنگ های فلورسنت مانند اتیدیوم بروماید یا آکریدین نارنجی نیز می توانند استفاده شوند، اما SYBR Green برای شدت سیگنال بالاتر بهتر است.

SYBR Green نسبت به پروب Taqman ترجیح داده می شود زیرا می تواند اطلاعاتی در مورد هر چرخه تقویت و همچنین در مورد دمای ذوب که از پروب Taqman به دست نمی آید ارائه دهد.

با این حال، نقطه ضعف آن عدم ویژگی خاص در مقایسه با کاوشگر Taqman است.

انواع RT-PCR

بر اساس اینکه مراحل رونویسی معکوس و تقویت یا در یک واکنش (یا لوله) یا در دو واکنش جداگانه (یا لوله) رخ می دهد، RT-PCR را می توان به دو نوع طبقه بندی کرد:

1.  RT-PCR تک مرحله ای

این یک نوع RT – PCR است که در آن رونویسی معکوس و واکنش های تقویت در یک لوله رخ می دهد. تمام اجزای مورد نیاز در یک لوله اضافه می شوند. ابتدا رونویسی معکوس رخ می دهد و cDNA را تشکیل می دهد که سپس در یک فرآیند PCR تقویت می شود.

مزایای RT-PCR یک مرحله ای نسبت به RT-PCR دو مرحله ای

  1. دارای یک راه اندازی ساده و آسان است.
  2. دقت و ویژگی بالاتری دارد.
  3. احتمال آلودگی کمتری دارد.
  4. یک روش ارزانتر و سریعتر است.

معایب RT-PCR یک مرحله ای نسبت به RT-PCR دو مرحله ای

  1. به دلیل استفاده از چندین ماده شیمیایی در یک لوله واکنش، الگوهای کمتری را در هر مخلوط واکنش تشخیص می‌دهد.
  2. به دلیل تشخیص کمتر الگو، برای شروع به یک الگوی بزرگتر نیاز دارد.
  3. اجازه ذخیره سازی و تجزیه و تحلیل بیشتر cDNA تشکیل شده در طول واکنش را نمی دهد.
  4. احتمال اتصال پرایمر-دایمر و اتصال غیر اختصاصی بیشتر است.
  5. احتمال شکست واکنش نسبتاً زیاد است.
ریل تایم PCR

2.  RT-PCR دو مرحله ای

این نوع دیگری از RT – PCR است که در آن رونویسی معکوس و فرآیند تقویت در دو لوله جداگانه انجام می شود. در لوله اول، یک واکنش رونویسی معکوس انجام می شود و cDNA تولید می کند. سپس این cDNA ها به لوله دیگری منتقل می شوند که در آنجا مخلوط PCR اضافه می شود و cDNA ها تقویت می شوند.

مزایای  RT–PCR دو مرحله نسبت به  RT–PCR تک مرحله

  1. این به ما اجازه می دهد تا cDNA تشکیل شده توسط رونویسی معکوس را ذخیره کنیم.
  2. راندمان، دقت و قابلیت اطمینان بالاتری دارد و الگوهای بزرگتر را در هر مخلوط واکنش تشخیص می دهد.
  3. در مقایسه، احتمال شکست واکنش، اتصال غیر اختصاصی و پیوند پرایمر-دایمر کمتر است.

معایب RT-PCR دو مرحله ای نسبت به RT-PCR یک مرحله ای

  1. احتمال آلودگی بیشتر است.
  2. این فرآیند پیچیده‌تر و خسته‌کننده‌تر است که به منابع بیشتر و یک فرد آموزش‌دیده نیاز دارد.

کاربردهای RT-PCR

  • مطالعه بیان ژن
  • شناسایی گونه های ناشناخته
  • تشخیص بیماری های عفونی
  • درج ژن و مطالعه ژن درمانی
  • مطالعه جهش و سلول های سرطانی
  • ابزارهای مهندسی ژنتیک و مطالعه ویروسی

  • مطالعه بیان ژن

روش سنتی نورترن بلات به نمونه mRNA بزرگتری برای تجزیه و تحلیل و مطالعه بیان ژن نیاز دارد. با این حال، با استفاده از RT-PCR، می‌توانیم نمونه mRNA ریزتری را تقویت کنیم و توالی نوکلئوتیدها را مطالعه کنیم، بنابراین بیان ژن را تجزیه و تحلیل کنیم. در مطالعه و شناسایی ژن های مقاوم به چند دارو و بیان آنها در پاتوژن ها استفاده می شود.

  • شناسایی گونه های ناشناخته

RT-PCR برای شناسایی ویروس هایی مانند HIV، ویروس SARS، ویروس دنگی، HCV و غیره استفاده می شود. علاوه بر این، سایر میکروارگانیسم ها و حتی ارگانیسم های بالاتر با مطالعه rRNA و mRNA آنها شناسایی می شوند.

تشخیص بیماری های عفونی

تشخیص انواع عفونت های ویروسی، عفونت باکتریایی، عفونت قارچی و انگلی، سلول های سرطانی و بیماری های ژنتیکی با استفاده از تکنیک RT-PCR در آزمایشگاه های بالینی انجام می شود.

درج ژن و مطالعه ژن درمانی

RT-PCR برای تهیه cDNA از mRNA یوکاریوتی که فاقد اینترون است و می تواند به پروکاریوت ها وارد شود، استفاده می شود. RT-PCR در نظارت بر نتیجه درج ژن و ژن درمانی استفاده می شود. این روش‌ها قرار است بیان ژن و کد یک پروتئین خاص را نشان دهند، بنابراین انواع خاصی از توالی‌های mRNA را ترجمه می‌کنند. این توالی mRNA خاص را می توان با استفاده از RT-PCR آنالیز کرد.

مطالعه جهش و سلول های سرطانی

RT-PCR می تواند آلل های جهش یافته بافتی را شناسایی و کمیت کند. همچنین می تواند هر گونه تغییر نامطلوب در توالی mRNA و mRNA های منحصر به فرد را که تنها توسط انواع مختلف سلول های سرطانی در بدن ما تولید می شوند، شناسایی کند.

ایزارهای مهندسی ژنتیک و مطالعه ویروسی

RT-PCR در مهندسی ژنتیک برای تجزیه و تحلیل DNA های اصلاح شده و RNA های رونویسی شده آنها و تقویت RNA هدف استفاده می شود.

مزایا

مزایای زیادی نسبت به PCR معمولی دارد:

  • این نگاهی به واکنشی می‌دهد که کمک می‌کند تصمیم بگیریم کدام واکنش‌ها خوب کار کرده‌اند و کدام‌یک شکست خورده‌اند.
  • بازده واکنش را می توان دقیقاً محاسبه کرد.
  • نیازی به اجرا کردن محصول PCR بر روی ژل پس از واکنش نیست زیرا تجزیه و تحلیل منحنی مذاب این هدف را انجام می دهد.
  • داده های PCR بلادرنگ را می توان برای انجام تجزیه و تحلیل کمی واقعاً بیان ژن استفاده کرد. در مقایسه، PCR قدیمی در بهترین حالت فقط نیمه کمی بود.
  • سریعتر از PCR معمولی.
  • پیچیدگی کمتر در تعیین کمیت نمونه و غیره
  • بنابراین، بر خلاف PCR آماده سازی معمولی، ریل تایم PCR اجازه می دهد تا موفقیت واکنش چندگانه PCR به طور خودکار پس از چند سیکل، بدون تجزیه و تحلیل جداگانه هر واکنش تعیین شود و از مشکل “منفی کاذب” جلوگیری می کند.

درحال حاضر مجموعه کیمیا زیست گستر نوین قادر به ارائه انواع مواد اولیه با گریدهای غذایی، دارویی، آرایشی، بهداشتی و صنعتی در حجم های بالا و کیفیت عالی از تولید کننده های معتبر می باشد. درصورت نیاز می توانید درخواست خود را با ما درمیان گذاشته تا در سریعترین زمان ممکن اطلاعات لازم را در اختیارتان قرار دهیم.