Real-Time PCR چیست؟

Real Time PCR از زمان معرفی تاکنون، در بسیاری از آزمایشگاه های بالینی برای تشخیص بیماری های عفونی به کار می رود. موفقیت این روش به دلیل ایجاد خصوصیات شیمیایی جدید و داشتن ابزار دقیق تری است که به آن توانایی شناسایی محصولات PCR در زمان کمتری درون یک سیستم بسته را می دهد. همچنین، دستگاه های real time PCR سریع تر از ترموسایکلر معمولی دما را تغییر می دهد و به دلیل افزایش حساسیت تشخیص فلورسنت، در مقایسه با چرخه ی PCR معمولی در یک محدوده ی دینامیکی بسیار گسترده تری عمل می کنند.

سیستم تشخیص و آنالیز داخلی، کمیت و تایید محصول را با یک نتیجه ی خروجی ارائه می دهد، که به گزارش الکتریکی منجر می شود.

تفاوت Real-Time PCR با PCR روتین

تفاوت اصلی RT-PCR با PCR روتین، استفاده از آنزیم RT ویروس های خانواده رتروویریده مثل AMV و MMLV می باشد. آنزیم RT دارای خاصیت غلط گیری و سه پریم به پنج پریم اگزونوکلئازی نمی باشد. میزان خطای آنزیم AMV RT با توجه به سرعت بیشتر آن دو برابر MMLV RT می باشد. با توجه به دمای بهینه ی فعالیت AMV RT در دمای 42 الی 52 و دمای بهینه ی فعالیت آنزیم MMLV RT در دمای 37 درجه سانتیگراد، آنزیم AMV RT برای رونویسی معکوس الگوهای RNA غنی از GC مناسب تر است.

تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک PCR معمولی نیاز است در تکنیک Real time PCR (ریل تایم پی سی آر) هم بکار می‌رود، اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد.

به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را مورد تخمین قرار داد.

به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد، که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه (سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود.

مسیر RT-PCR

فاز اول The baseline region: با وجود اینکه محصول دو رشته ای وجود دارد ولی نور آن قابل ردیابی نیست.
فاز دوم The exponential phase: محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد نمایی مربوط به واکنش شروع می شود.
فاز سوم The liner phase: ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
فاز چهارم The plateau phase: ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایش در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.

Real-Time PCR تک مرحله ایی و دو مرحله ایی

RT-PCR خود به دو صورت یک مرحله ایی (One step) و دو مرحله ایی (Two step) قابل اجرا است. در RT-PCR یک مرحله ایی شما قادر خواهید بود بر روی نمونه هم واکنش سنتز cDNA و هم PCR استاندارد را انجام دهید. مزایای این روش سرعت، آسانی کار، تکرارپذیری بالا و کاهش احتمال آلودگی می باشد. اگر نیاز دارید که cDNA خود را برای مدتی نگه دارید یا قصد انجام Multiplex PCR دارید، از روش معمول RT-PCR دو مرحله ایی استفاده کنید. تفاوت دیگر RT-PCR با PCR روتین استفاده از پرایمر است. در RT-PCR می توانیم از سه نوع پرایمر استفاده کنیم:

پرایمر رندوم هگزامر
پرایمر اولیگودئوکسی تیمیدین
پرایمر اختصاصی

روش‌های شناسایی Real time PCR

در سالیان اخیر پیشرفت‌های تکنیکی زیادی اتفاق افتاده و ابزار زیادی در این روش بکار رفته که مهمترین آن شاید اختراع دستگاه‌های چند کاناله باشد. این دستگاه‌ها قادرند به صورت همزمان چندین طول موج نوری متفاوت را تابانیده و بازتابش آن را ثبت نمایند. دراین تکنیک، برای تعیین غلظت DNA از رنگ های فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده میشود.

کنترل Real-Time PCR

کنترل استخراج RNA: برای اطمینان از این که کیفیت مخلوط واکنش مشکلی نداشته و تکثیر به درستی انجام نشده باشد، می توانیم از کنترل داخلی به عنوان کنترل کننده مراحل انجام شده استفاده کرد. یعنی مثبت شدن این ژن ها، نشان از جداسازی صحیح فرایند استخراج دارد.
کنترل آلودگی DNA: برای کنترل وجود آلودگی DNA همراه با RNA، یک مخلوط واکنش به عنوان کنترل مشابه پروتکل RT-PCR را بدون اضافه کردن آنزیم RT درست کرده و سایر مراحل را انجام دهید. اگر فقط در نمونه اضافه شده به مخلوط واکنش RNA باشد، هیچ محصولی بعد از پایان کار مشاهده نمی شود. اما اگر همراه با RNA، نمونه اضافه شده به مخلوط واکنش دارای آلودگی با DNA باشد، محصول بدون وجود آنزیم RT نیز دارای DNA می باشد.

مراحل انجام RT-PCR

مخلوط RNA کرونا ویروس همراه با پرایمر و آب فاقد نوکلئاز را ابتدا در دمای 65 الی 80 درجه سانتیگراد به مدت 3 الی 5 دقیقه برای از بین بردن ساختار ثانویه RNA حرارت داده و بلافاصله مخلوط واکنش را به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار دهید.

به مخلوط اول، سایر اجزا شامل dNTP_s، آنزیم RT، بافر RT و مهارکننده RNase را اضافه کنید. مخلوط واکنش را درون دستگاه گذاشته، ابتدا 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد برای کارایی بهتر پرایمرها قرار داده شود. بسته به نوع آنزیم (AMV RT یا MMLV RT) در دمای 37 الی 60 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت.

قرار دادن در دمای 85 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه برای غیرفعال کردن آنزیم RT. محصول واکنش را می توان مستقیماً برای واکنش Real time PCR استفاده نمود و یا در منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری کرد. برای نگهداری طولانی مدت دمای منفی 70 درجه سانتیگراد توصیه میشود.

موادی که برای هر Reaction در Real Time PCR استفاده می شود:

پرایمر Forward و Reverse پروب دار شده – dNTP_S – آب فاقد نوکلئاز – آنزیم Taq پلی مراز. اگر Real Time PCR یک مرحله ایی باشد، همزمان با غیرفعال کردن آنزیم RT آنزیم Taq پلی مراز فعال می شود. در مرحله بعد به دستگاه دمای 95 درجه سانتیگراد و مدت زمان 5 ثانیه جهت دناتوره کردن دو رشته cDNA داده می شود. سپس به دستگاه دمای 60 درجه سانتیگراد به منظور اتصال پرایمر، طویل سازی و اندازه گیری فلورسانس داده می شود.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.