اولتراسانتریفیوژ

• تعریف اولتراسانتریفیوژ
• اصول
• انواع
• قطعات
• رویه
• موارد استفاده

تعریف اولتراسانتریفیوژ

اولتراسانتریفیوژ یک سانتریفیوژ پیشرفته است که با سرعت بسیار بالایی کار می کند و مولکول های کوچکتری را که نمی توان از سانتریفیوژهای سنتی جدا کرد جدا می کند. سرعت روتورها در اولتراسانتریفیوژ می تواند از 60000 دور در دقیقه تا 150000 دور در دقیقه باشد. این دستگاه ها عمدتاً در آزمایشگاه های تسهیل شده‌تر برای انجام عملیات پیشرفته‌تر کار می‌کنند. اینها از نظر اندازه بزرگتر هستند و می‌توانند نمونه‌ها را به صورت دسته‌ای (batches) یا به عنوان یک سیستم جریان پیوسته (continuous flow system) کار کنند.

اکثر اولتراسانتریفیوژها به منظور کنترل گرمایی که ممکن است به دلیل سرعت بیش از حد تولید شود، در یخچال نگهداری می‌شوند.

اصول Ultracentrifuge

اولتراسانتریفیوژ مانند همه سانتریفیوژهای دیگر کار می کند.

کار یک اولتراسانتریفیوژ بر اساس اصل ته‌نشینی است، که بیان می‌کند که ذرات متراکم‌تر در مقایسه با ذرات متراکم کمتر تحت گرانش، سریعتر ته‌نشین می‌شوند.

با این حال، ته‌نشین شدن ذرات تحت گرانش زمان بیشتری می‌برد و به همین دلیل است که نیروی اضافی برای کمک به فرآیند ته‌نشینی اعمال می‌شود. در اولتراسانتریفیوژ، نمونه حول یک محور می‌چرخد ​​و در نتیجه نیروی عمودی به نام نیروی گریز از مرکز ایجاد می‌شود که بر ذرات مختلف روی نمونه اثر می‌گذارد. مولکول‌های بزرگتر سریعتر حرکت می‌کنند، در‌حالی‌که مولکول‌های کوچکتر کندتر حرکت می‌کنند.

در همان زمان، مولکول‌های متراکم‌تر به سمت بیرون به سمت حاشیه لوله‌ها حرکت می‌کنند، در‌حالی‌که مولکول‌های چگالی کمتر به سمت مرکز لوله می‌چرخند. پس از تکمیل فرآیند، ذرات بزرگتر و متراکم‌تر ته‌نشین می‌شوند و گلوله‌هایی را در پایین لوله تشکیل می‌دهند. در مقایسه، ذرات کوچک‌تر و کم‌تراکم‌تر یا در سطح معلق باقی می‌مانند یا روی سطح شناور می‌شوند.

انواع اولتراسانتریفیوژ

بر اساس کاربرد و هدف، اولتراسانتریفیوژ دو نوع است.

آ. اولتراسانتریفیوژ تحلیلی Analytical ultracentrifuge (AUC)

• همانطور که از نام آن پیداست، سانتریفیوژهای تحلیلی، اولتراسانتریفیوژهایی هستند که برای تجزیه و تحلیل ذرات مختلف موجود در نمونه استفاده می‌شوند.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (AUC) یک روش همه‌کاره و قوی برای تجزیه و تحلیل کمی ماکرومولکول‌ها در محلول است.
• این اولتراسانتریفیوژها دارای سیستم‌های تشخیص برای نظارت بر چرخش و موقعیت ذرات در زمان واقعی برای تعیین ضریب رسوب هستند که به تجزیه و تحلیل ذرات بر اساس شکل، اندازه و جرم کمک می‌کند.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی برای تعیین جرم مولکولی نسبی یک ماکرومولکول را می‌توان با رویکرد سرعت ته‌نشینی یا روش تعادل ته‌نشینی انجام داد.
• خواص هیدرودینامیکی ماکرومولکول‌ها با ضرایب ته‌نشینی آنها توصیف می‌شود.
• ضرایب را می‌توان از روی سرعت حرکت مرز غلظتی از مولکول‌های زیستی خاص در میدان گرانشی تعیین کرد.
• ضریب رسوب را می توان برای مشخص کردن تغییرات در اندازه و شکل ماکرومولکول‌ها با تغییر شرایط تجربی استفاده کرد.
• سه سیستم نوری برای اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (جذب، تداخل، و فلورسانس) موجود است که امکان مشاهده دقیق و انتخابی رسوب را در زمان واقعی فراهم می کند.
• یکی از نمونه‌های سیستم‌های تشخیص مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ، سیستم نوری Schlieren است که ذرات موجود در سانتریفیوژ را در زمان واقعی مشاهده می‌کند تا موقعیت و حرکت آنها را تعیین کند.
• بر اساس موقعیت، ضرایب رسوب را می‌توان تعیین کرد، که امکان تعیین خواص مولکول‌های مختلف را فراهم می‌کند.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی بیشتر برای تعیین خواص بیومولکول‌ها مانند پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.

ب. اولتراسانتریفیوژ آماده‌سازی (Preparative ultracentrifuge)

• اولتراسانتریفیوژهای آماده‌سازی سانتریفیوژهایی هستند که عمدتاً برای جداسازی و جداسازی ذرات در یک نمونه با فرآیند سانتریفیوژ استفاده می‌شوند.
• در اجرای مقدماتی اولتراسانتریفیوژ، محتویات لوله‌ها پس از دوره سانتریفیوژ تجزیه و تحلیل می‌شود، برخلاف سانتریفیوژ تحلیلی که در آن تجزیه و تحلیل در طول فرآیند سانتریفیوژ انجام می‌شود.
• اولتراسانتریفیوژهای آماده‌سازی را می‌توان برای انواع مختلفی از فرآیندهای سانتریفیوژ مانند سانتریفیوژ با گرادیان چگالی، سانتریفیوژ دیفرانسیل و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک استفاده کرد.
• ذرات در یک نمونه یا بر اساس چگالی یا اندازه آنها از هم جدا می شوند.
• در سانتریفیوژ با گرادیان چگالی و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک، ذرات نمونه بر اساس چگالی آنها جدا می شوند. ذرات مختلف موجود در یک نمونه به شکل نوارهایی در سطوح مجزا جدا می شوند که چگالی ذره با چگالی محیط برابر است.
• اما در سانتریفیوژ دیفرانسیل، ذرات با اعمال سرعت های مختلف روتورها جدا می شوند. ذرات بزرگتر در سرعت های پایین تر ته نشین می شوند در حالی که ذرات کوچکتر به سرعت بالاتری برای جداسازی نیاز دارند.
• از آنجایی که ذرات بر اساس چگالی و اندازه جدا می‌شوند، می‌توان از اولتراسانتریفیوژهای آماده‌سازی برای تعیین چگالی و اندازه ذرات مختلف استفاده کرد.

ابزار دقیق/ قطعات اولتراسانتریفیوژ

اولتراسانتریفیوژها با قطعات و اجزای مختلف ارائه می شوند و عملکردهای مختلفی را انجام می دهند. روتورها جزء ضروری هر اولتراسانتریفیوژ هستند. اولتراسانتریفیوژها از هر سه نوع روتور، یعنی روتورهای عمودی (vertical rotors)، روتورهای سطلی نوسانی (swinging bucket rotors) و روتورهای با زاویه ثابت (fixed-angle rotors) استفاده می کنند. روتور سطل نوسانی رایج ترین روتور مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ است زیرا بالاترین غلظت ذرات را ایجاد می کند. این به این دلیل است که جهت نیروی گریز از مرکز در روتورهای عمودی با موقعیت لوله ها هماهنگ است.

درایو (drive) واحد قدرتی است که سلول ها یا لوله های نگهدارنده روتور را که حاوی محلول مولکول ها یا ذرات معلق هستند می چرخاند. علاوه بر درایو الکتریکی قابل تعویض و روتورها، شامل روتورهای تحلیلی (analytical rotors) با حداکثر چهار سلول، دستگاه های دما با برد و کنترل از 0 تا 40 درجه، سلول هایی با ضخامت هایی که ضریب حساسیت 10 را پوشش می دهند، و پنجره های کوارتز گوه ای (wedge quartz windows) که اجازه چندین سلول را می دهد. به طور همزمان استفاده شود.

سیستم دما امکان کنترل دما را در سیستم فراهم می کند زیرا تولید گرما در طول عملیات اولتراسانتریفیوژ در سرعت های بالا رایج است. اولتراسانتریفیوژ تحلیلی همچنین دارای یک مقایسه کننده دو بعدی (two-dimensional comparator) با ماشین حساب میز چاپ (printing desk calculator)، تداخل و سیستم های نوری جذب (absorption optical systems) است.

سیستم های نوری برای تجزیه و تحلیل بلادرنگ مولکول ها ضروری هستند.

علاوه بر این، یک دستگاه ایجاد گرادیان (gradient-forming device)، رفرکتومترهای دستی (hand refractometers)، و یک اسپکتروفتومتر ضبط کننده (recording spectrophotometer) با سلول جریان (flow cell) و کلکتور کسری (fraction collector) نیز ممکن است در یک اولتراسانتریفیوژ آماده سازی وجود داشته باشد.

روش/ مراحل اولتراسانتریفیوژ

فرآیند کار یک اولتراسانتریفیوژ ممکن است بسته به اینکه یک اولتراسانتریفیوژ تحلیلی باشد یا یک اولتراسانتریفیوژ مقدماتی متفاوت باشد.

به طور کلی، مراحل زیر در هنگام انجام اولتراسانتریفیوژ تحلیلی باید دنبال شود:

اندازه های کوچک نمونه (20-120 میلی متر مکعب) در سلول های تحلیلی گرفته می شود تا در داخل اولتراسانتریفیوژ قرار گیرند.
سپس اولتراسانتریفیوژ به گونه‌ای عمل می‌کند که نیروی گریز از مرکز باعث مهاجرت مولکول‌های زیستی توزیع‌شده تصادفی از طریق حلال به صورت شعاعی به سمت خارج از مرکز چرخش می‌شود.
فاصله مولکول ها از مرکز از طریق سیستم نوری Schlieren تعیین می شود.
نموداری از غلظت املاح در مقابل مجذور فاصله شعاعی از مرکز چرخش رسم می شود که بر اساس آن جرم مولکولی تعیین می شود.
روش زیر برای عملکرد اولتراسانتریفیوژ آماده سازی است:

 1. سانتریفیوژ گرادیان چگالی

• در اولتراسانتریفیوژ آماده سازی با استفاده از گرادیان چگالی، باید یک گرادیان چگالی تهیه شود.
• برای این کار، یک لایه ساکارز با غلظت کمتر روی یک لایه ساکارز غلیظ تر اعمال می شود که یک گرادیان چگالی ساکارز ایجاد می کند.
• برخی از اولتراسانتریفیوژها دارای دستگاه‌های شیب‌ساز هستند که می‌توانند به تنهایی گرادیان را بسازند.
• سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ تحت گرادیان قرار می گیرد و سپس لوله ها در قفسه روتورهای اولتراسانتریفیوژ قرار می گیرند.
• قبل از شروع فرآیند، دما و زمان در اولتراسانتریفیوژ تنظیم می شود.
• درب بسته می شود و فرآیند شروع می شود.
• ذرات از طریق گرادیان حرکت می کنند تا زمانی که به نقطه ای برسند که در آن چگالی آنها با چگالی محیط اطراف مطابقت داشته باشد.
• کسری ها برداشته و جدا می شوند و ذرات به عنوان واحدهای جدا شده به دست می آیند.

2. سانتریفیوژ افتراقی

• در سانتریفیوژ افتراقی، نمونه در محیط حاوی بافر همگن می شود.
• سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ قرار می گیرد که در یک نیروی گریز از مرکز خاص برای مدت زمان مشخصی در یک دمای خاص عمل می کند.
• در پایان این عمل، گلوله ای در پایین لوله تشکیل می شود که از مایع رویی جدا می شود.
• مایع رویی به یک لوله سانتریفیوژ جدید اضافه می شود و در آنجا با سرعت دیگری برای زمان و دمای خاص سانتریفیوژ می شود.
• مجدداً مایع رویی از گلوله های تشکیل شده جدا می شود.
• این مراحل تا زمانی ادامه می یابد که همه ذرات از یکدیگر جدا شوند.
• سپس ذرات را می توان با آزمایش شاخص هایی که مختص ذرات خاص هستند شناسایی کرد.

موارد استفاده

• اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی در زیست شناسی برای کسر گلوله شونده (pelleting fraction) از اندامک های سلولی مانند میتوکندری، ریبوزوم ها و حتی ویروس ها استفاده می شود.
• سانتریفیوژ با گرادیان چگالی از شیب نمک سزیم برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مانند DNA و RNA استفاده می کند.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی به شما امکان می دهد تا تغییرات ساختاری ماکرومولکولی را به دلیل تغییرات pH، دما و سایر عوامل محیطی شناسایی و مشخص کنید.
• AUC همچنین امکان تعیین استوکیومتری ماکرومولکول های مختلف مانند جرم مولکولی، اندازه و غیره را فراهم می کند.
• اولتراسانتریفیوژهای تحلیلی همچنین به تمایز بین مونتاژ و جداسازی کمپلکس‌های بیومولکولی مختلف کمک می‌کنند.
• اولتراسانتریفیوژها همچنین در تعیین چگالی ماکرومولکول های مختلف استفاده می شوند.
• علاوه بر این، همچنین اجازه می دهد تا عصاره های خام بیولوژیکی مختلف را تصفیه کنید.

موارد احتیاط

اولتراسانتریفیوژها دستگاه‌های حساسی هستند، به همین دلیل است که باید با رعایت اقدامات احتیاطی کامل عمل کرد.

برخی از این اقدامات احتیاطی عبارتند از:

• در حین اجرای اولتراسانتریفیوژ، دستورالعمل سازنده همیشه باید رعایت شود.
• روتورها باید به دقت مورد استفاده قرار گیرند و باید به طور معمول برای علائم خوردگی و ترک مشاهده شوند.
• در حین افزودن لوله ها به روتورها، حجم نمونه در لوله ها باید برابر باشد.
• تعداد لوله های اضافه شده به اولتراسانتریفیوژ باید همیشه متعادل باشد.
• اگر بار نمونه کافی در دسترس نباشد، باید آب مقطر برای تنظیم به لوله ها اضافه شود.
• سرعت روتور نباید از مقدار تعیین شده تجاوز کند.
• درب محفظه باید همیشه در حین کار بسته بماند.
• برای جلوگیری از آسیب در روتورها، باید از راهنمای سازنده مراقبت و مدیریت روتور پیروی کرد.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.