واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

کشف واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) در سال 1983، تشخیص بیماری های عفونی را در آزمایشگاه های بالینی به طور سریع، اختصاصی، حساس و بدون نیاز به کشت، متحول ساخت. آزمایش های مبتنی بر PCR قادر به تکثیر مولکول های هدف با تعداد کم تا یک سطح قابل تشخیص از هر دو نوع سلول زنده و غیرزنده هستند.

واکنش زنجیره ایی پلیمراز (PCR)  ابزاری رایج برای تشخیص و شناسایی عامل ایجادکننده بیماری در آزمایشکاه های تشخیصی میکروبیولوژی است. انواع مختلفی از آزمایش های PCR به صورت معمولی و ساده تا به شکل Real Time تکامل یافته اند.

اجزای مورد استفاده در RT-PCR / PCR

1- پرایمر و پروب ها

• پرایمرها

  رشته های نوکلئوتیدی هستند که به وسیله ی روش های شیمیایی سنتز می شوند، که بعد از اتصال به ناحیه ی هدف، انتهای OH-3 مورد نیاز برای پلی مراز را مهیا می سازد تا سنتز رشته ی مورد نظر انجام شود. همچنین به طور کل به پرایمرهای نشان دار پروب گفته می شود.

  پرایمر بالا یا Forward یا سنس به صورت قراردادی به پرایمری که به نزدیک ترین کدون آغاز ژن هدف متصل می شود و پرایمر پایین یا Reverse یا آنتی سنس به پرایمری که به نزدیک ترین کدون پایان ژن هدف متصل می شود، گفته می شود. نسبت پرایمر و الگو در پروتکل های استاندارد مورد استفاده از 0/25 تا 1 لاندا از پرایمر با غلظت 10 pmol و مقدار اولیه الگو 10 فمتوگرم تا 10 نانوگرم بسته به ماهیت DNA می باشد که نسبتی در حدود 10 میلیون پرایمر به 1 الگو می باشد.

  به عنوان مثال، میزان غلظت مورد استفاده DNA ژنومی بین 100 پیکوگرم تا 10 نانوگرم، مقدار DNA پلاسمیدی بین 10فمتوگرم تا 1 نانوگرم و میزان DNA تکثیریافته بین 1 فمتوگرم تا 10 پیکوگرم می باشد.

• پروب ها

  پرایمرهای نشان داری هستند که حاوی یک گروه اتصالی اضافی برای ردیابی بهتر پرایمر می باشند. این گروه اضافی می تواند خاصیت فلورسنس داشته باشد. شما می توانید از پروب ها با یک خاموش کننده یا پروب هایی با دو خاموش کننده استفاده کنید.

  پیشنهاد می شود که از پروب های با دو خاموش کننده استفاده کنید، زیرا فلورسنس پس زمینه پایین تری را نشان می دهند و در نتیجه در مقایسه با پروب های تک خاموش کننده دارای سیگنال قوی تری هستند. پروب هایی با دو خاموش کننده دارای یک خاموش کننده ی داخلی ZEN یا TAO هستند. خاموش کننده ی داخلی در پروب هایی با طول بلندتر باعث ایجاد خاصیت خاموش کنندگی قوی تر و در نتیجه افزایش سیگنال بالاتری می شوند.

  اگر از پروب هایی با یک خاموش کننده استفاده می کنید، سعی کنید طول آن 20 تا 30 باز باشد؛ این باعث می شود که خاموش کننده به طور بهینه فلورسانس رنگ را جذب کند (پروب با طول بیش از 30 باز، کارایی کمتر در خاموش کنندگی گزارشگر دارند)

شرایط طراحی پروپ

1. در حالت ایده آل بهتر است پروب در مجاورت پرایمر سنس یا پرایمر آنتی سنس باشد، اما نباید با سایت اتصال پرایمر بر روی همان رشته هم پوشانی داشته باشد، در این صورت پروب را می توان بر روی رشته ی دیگری از الگوی هدف طراحی کرد.
2.  دمای Tm پروب باید 6 تا 8 درجه بالاتر از پرایمر باشد، اگر Tm پایین باشد، درصد احتمال اتصال پروب به هدف کاهش می یابد. در این مورد پرایمرها، تکثیر را قبل از اتصال پروب شروع کرده، اما چون سایت های هدف با اتصال پروب اشباع نشده اند، حساسیت کاهش پیدا می کند و سیگنال فلورسانس کم شده که نشان دهنده ی مقدار واقعی از حضور هدف در نمونه نمی باشد.
3. دمای Tm نباید 5 درجه کمتر از دمای Tm پرایمر باشد.
4. درصد GC پروب همانند توالی پرایمر، بهتر است که بین 35 تا 65 درصد باشد و از قراردادن G در انتهای ‘5 پروب به خاطر اثر منفی بر روی خاموش کننده اجتناب کنید.

2- اسید نوکلئیک

در PCR، واکنش هایی که با مقدار خیلی کم از DNA انجام می گیرند، دارای بازده پایینی می باشند و از طرفی استفاده از مقدار زیاد DNA در مخلوط واکنش باعث ایجاد محصولات غیراختصاصی می شود. اگر در شروع واکنش در حدود ۱۰۰۰۰ الگو در مخلوط واکنش وجود داشته باشد، نیاز به ۲۵ تا ۳۰ سیکل واکنش PCR دارد، اما سعی کنید که میزان غلظت نهایی DNA را در مخلوط واکنش کمتر یا مساوی با ۱۰ نانوگرم در هر میلی لیتر برسانید و میزان غلظت RNA برای واکنش RT، یک الی 2 میکروگرم باشد.

زمانی که از یک محصول PCR به عنوان الگو استفاده می کنید،غلظت الگو به درستی معلوم نیست. به عنوان مثال، زمانی که از cDNA تولید شده در واکنش RT-PCR به عنوان الگو در واکنش PCR کیفی یا کمی استفاده می کنید، توصیه می شود که به نسبت ۱ به ۱۰ یا ۱ به ۱۰۰۰ cDNA را رقیق کرده و بعد استفاده کنید.

3-  آنزیم های پلی مراز

آنزیم Taq پلی مراز پرمصرف ترین آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت می باشد، که توانایی تکثیر قطعات با طول 4000 جفت باز را دارد (الگوی DNA با کیفیت بالا را می تواند تا 10000 جفت باز سنتز کند). Taq پلی مراز فاقد خاصیت تصحیح کنندگی ‘3 به ‘5 است و میزان خطای این آنزیم در اشتباه قرار دادن باز در رشته الگو یک باز در هر 9000 عدد باز است (این آمار برای آنزیم Pfu، خطا در 1/3 میلیون جفت باز می باشد) و میزان خطای آن در حذف یا اضافه کردن یک باز 1 به 4000 عدد باز است (می توان بدین منظور از آنزیم Pfu پلی مراز استفاده کرد که دارای خاصیت تصحیح کنندگی است).

• دمای بهینه

دمای بهینه آنزیم Taqپلی مراز 70 الی 75 درجه سانتی گراد است، که در دمای 55 الی 70 درجه سانتی گراد نیز دارای عملکرد مطلوبی می باشد، توانایی پیش روندگی 1000 نوکلئوتید در 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی گراد را دارد ( این آمار برای آنزیم Pfu یک تا دو دقیقه می باشد). این میزان پیش روندگی در دمای 55 درجه سانتی گراد، 24 جفت باز در ثانیه است. همچنین فعالیت در دمایی که میزان تشکیل ساختارهای دوم و سوم در زنجیره الگو کمتر تشکیل می شود، از مزایای دیگر آنزیم Taq می باشد.

• مقاومت دمایی

البته مقاومت دمایی این آنزیم به این صورت است که داری نیمه عمر ۲ ساعته در دمای 92/5 درجه سانتی گراد، 40 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد و 9 دقیقه در دمای  97/5 درجه سانتی گراد است (نیمه عمر آنزیم Pfu در دمای 95 درجه سانتی گراد، 6 ساعت می باشد) و در یک سیکل 50 تایی با دمای دناتوره شدن 95 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه، حدود 50 درصد از عملکرد خود را از دست می دهد.

• حساسیت

آنزیم Taq پلی مراز نسبت به وجود پروتئاز، آلودگی مخلوط واکنش با دوزهای مشخصی از DMSO ، EDTA، اوره، آگار و آگارز، فنول، اتانول, ایزوپروپانول، سدیم سیترات، SDS و فرمامید، پلی ساکاریدهای گیاهی و نیز بازدارندهای آزادشده از پلیت های پلاستیکی با منشأ پلی استیرن ناشی از استریل کردن با اشعه فرابنفش حساس است.

dNTP در هر مخلوط واكنش بر اثر چرخه ی دمایی در هر سیکل تخریب می گردد، به عنوان مثال در طول یک چرخه 40 تایی برنامه ی PCR در حدود 50 درصد از مقدار اولیه dNTP واردشده به واکنش از بین می رود.

آنزیم رونویسی معکوس (Reverse Transcriptase)

آنزیم (RT) Revers Transcriptase دارای خاصیت غلط گیری و ‘3 به ‘5 اگزونوکلئازی نمی باشد. میزان خطای آنزیم AMV RT با توجه به سرعت بیشتر آن دو برابر MMLV RT  می باشد. با توجه به دمای بهینه ی فعالیت AMV RT در دمای 42 الی 52 درجه سانتی گراد و دمای بهینه ی فعالیت آنزیم MMLV RT در دمای 37 درجه سانتی گراد، آنزیم AMV RT برای رونویسی معکوس الگوهای RNA غنی از GC مناسب تر است.

4- داکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP)

داكسی نوکلئوتید تری فسفات ها (dNTP) در واقع آجرهای ساختمانی بوده که برای ساخت رشته اسید نوکلئیک توسط آنزیم پلی مراز ضرروی هستند. غلظت های مورد استفاده در PCR استاندارد 10 تا 200 میکرو مولار می باشد، که به طور روتین 1 میکرولیتر از غلظت 10 میکرومولار dNTP در 20 میکرولیتر مخلوط واکنش استفاده می گردد. به همین خاطر غلظتی از dNTP استفاده می شود که در پایان واکنش مقداری از dNTP باقی مانده باشد.

همچنین افزایش dNTP موجب کاهش اختصاصیت و حساسیت PCR می شود. dNTP با خلوص بالا نیز زمانی استفاده می شود که شما به دنبال کپی پایین از DNA هدف باشید. این dNTPها دارای داکسی نوکلئوتید دی فسفات کمتر از 0/9 درصد، فاقد تترا پیروفسفات و نوکلئوتید تغییریافته می باشند.

یکی از عملکردهای dNTP داشتن بار منفی در Ph=7.2 و اتصال آن با یون های منیزیم است، که به عنوان کوفاکتور مورد نیاز برای عملکرد و بازده آنزیم پلی مراز استفاده می شود. کاهش مقدار dNTP باعث کاهش در اتصال به منیزیم و آنزیم پلی مراز گشته و در نتیجه بازده PCR را پایین می آورد. در مواردی بهینه سازی غلظت dNTP و منیزیم به علت اتصال و تاثیر برهمدیگر لازم می باشد.

• اینوزین

5- بافر واکنش

به منظور فراهم کردن شرایط تکثیر مناسب و واکنش بهتر پرایمر و الگو در یک محدوده ی pH مناسب، وجود پروتئین در سیستم بافری برای تثبیت آنزیم پلی مراز و سیستم بافری در واکنش PCR مورد نیاز است. انواع مختلفی بافر بسته به نوع خواسته ی ما در بازار وجود دارد.

تریتون 100-X، بتائین و تویین-۲۰ دترجنت های غیریونی هستند که مانع ایجاد ساختارهای ثانویه می شوند، که باعث اتصال راحت تر پرایمر به الگو شده و نیز مانع غیرفعال شدن پلیمراز در اثر پروتئاز و یا در طی چرخه های دمایی، می شوند. بتائین، پیروفسفاتاز باعث حذف عوامل پیروفسفات (تشکیل شده در طول انجام واکنش PCR که جز عوامل مهارکننده PCR می باشند) می شوند.

بتائین همچنین به تعادل ترمودینامیکی بازهای GC و AT کمک می کند. استفاده از DMSO و یا تترامتیلن سولفوکساید با تسهیل در جداسازی رشته نیز باعث افزایش کارایی واکنش و کاهش اشتباه در اتصال پرایمر به الگو می شوند.

• Dichlorodiphenyltrichloroethane

استفاده از Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) به عنوان یک عامل احیاکننده، باعث حفظ ساختار کانفورماسیون جایگاه فعال آنزیم DNA پلی مراز می شود. استفاده از فرمامید و یا تترامتیل آمونیوم کلراید، با کاهش پایداری جفت بازها موجب کاهش تکثیر غیر اختصاصی در واکنش PCR می شوند و همچنین از آپتامرها نیز به عنوان بازدارنده های اولیگونوکلئوتیدی برای جلوگیری از فعالیت آنزیم پلی مراز در مراحل اول گرمایش می توان استفاده نمود.

• پروتئین

پروتئین هایی نیز در واکنش PCR مورد استفاده قرار می گیرند، از جمله پروتئین ژن 32 باکتریوفاژ T4، که باعث پایداری DNA تک رشته ای و کارامدی PCR می شود، که می توان در تکثیر الگوهای بلند از آن استفاده کرد.

6- یون های موجود در مخلوط واکنش PCR

یون های موجود در مخلوط واکنش شامل سدیم، پتاسیم، آمونیوم و منیزیم هستند. سدیم، پتاسیم و آمونیوم دارای بار مثبت هستند که در غلظت مناسب باعث تحریک آنزیم پلی مراز و پوشش دادن بارهای منفی گروه فسفات رشته الگو می شوند، که در نتیجه نیروی دافعه بین پرایمر و DNA که هردو دارای بار منفی هستند، را کاهش می دهند. آمونیوم همچنین در رقابت با باندهای هیدروژنی رشته های DNA، باعث تسهیل اتصال پرایمر و DNA می شود.

یون منیزیم با دو بار مثبت به عنوان کوفاکتور آنزیم پلی مراز شناخته می شود. غلظت این یون باید در پروتکل مخلوط واکنش همسو با عملکرد آنزیم پلی مراز باشد و در بیشتر مواقع نیاز به پیدا کردن نسبت بهینه منیزیم با نسبت dNTP در مخلوط واکنش می باشد. محدود مورد استفاده غلظت 0/5 تا 5 میلی مولار می باشد، که غلظت 1/5 تا 2/5 بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد.

توجه داشته باشید که افزایش غلظت منیزیم باعث مهار آنزیم پلی مراز و نیز اتصال اشتباه نوکلئوتیدها می شود، به طوریکه در غلظت 10 میلی مولار فعالیت آنزیم 50 درصد کاهش می یابد.

7- لوله واکنش

لوله واکنش باید دارای دیواره نازک و ظرفیت انتقال گرمایی بالایی باشد و در زمان انجام واکنش باید کاملاً بسته و نفوذناپذیر باشد تا از تبخیر اجزای مخلوط واکنش جلوگیری شود. برای واکنش PCR لوله های با درب متصل محدب و یا صاف، استریپ های چندتایی و لوله های با درپوش صاف بهینه شده اند.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.