خالص سازی RNA

خالص سازی RNA کل از سلول های باکتریایی

خالص سازی RNA از سلول ها یا بافت های حیوانی

جداسازی RNA کل از سلول های باکتریایی

RNA کل از DNA و پروتئین های سلول پس از استخراج با محلولی به نام ترایزول  جدا می شود. ترایزول یک محلول اسیدی حاوی گوانیدینیم تیوسیانات (GITC)، فنل و کلروفرم است. GITC به طور برگشت ناپذیر پروتئین ها و RNase ها را دناتوره می کند. به دنبال آن سانتریفیوژ انجام می شود. در شرایط اسیدی، RNA کل در فاز آبی بالایی باقی می‌ماند، در حالی که بیشتر DNA و پروتئین‌ها در فاز بین‌فاز یا در فاز آلی پایین‌تر باقی می‌مانند. سپس RNA کل با رسوب با ایزوپروپانول بازیابی می شود. آنزیم های RNase را می توان با استفاده از دی اتیل پیروکربنات (DEPC) غیر فعال کرد.

RNA Isolation Protocol

مواد مورد نیاز برای جداسازی RNA

  • کشت باکتری
  • ترایزول
  • کلروفرم
  • محلول ایزوپروپانول
  • بافر TAE
  • اتانول 70%

روش جداسازی RNA

  1. 800 میکرولیتر از کشت باکتریایی را در میکروتیوب جدید بریزید.
  2. به این مقدار 160 میکرولیتر ترایزول (یک پنجم حجم کشت) اضافه کنید.
  3. محلول را با پیپت کردن چندین بار به خوبی مخلوط کنید.
  4. به این مقدار 32 میکرولیتر کلروفرم (یک پنجم حجم تریزول) اضافه کنید.
  5. 2 تا 5 دقیقه انکوبه کنید و با 12000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید.
  6. فاز آبی را به یک لوله جدید منتقل کنید و به حجم مساوی ایزوپروپانول اضافه کنید. خوب مخلوط کنید.
  7. با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید.
  8. مایع رویی را دور بریزید و رسوب را مجدداً در اتانول 70 درصد حل کنید. دوباره با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید.
  9. مایع رویی را دور بریزید.
  10. رسوب را با هوا در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 10-15 دقیقه خشک کنید.
  11. رسوب را مجدداً در 50 میکرولیتر بافر TE حل کنید.
  12. نمونه RNA را به صورت کمی و کیفی تجزیه و تحلیل کنید.

جداسازی RNA از سلول ها یا بافت های حیوانی

  • مواد معرف
  • ابزار
  • روش

مواد معرف

  1. معرف TRIZol
  2. کلروفرم

ابزار

  • هود
  • ورتکس
  • میکروپیپت ها
  • میکرو سانتریفیوژ سرد
  • هموژنایزر پلیت

روش

  1. محل کار (شفت پیپتور، میز) را با محلول ضدعفونی کننده سطحی که RNase ها را از بین می برد، تمیز کنید.
  2. میکروسانتریفیوژ را تا 4 درجه سانتیگراد خنک کنید.
  3. همگن سازی بافت تازه یا کشت سلولی:
  • بافت تازه برای جداسازی بهینه RNA ارجح است. متناوباً، بافت باید بلافاصله پس از تشریح در معرف تثبیت کننده RNA غوطه ور شود و در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شود.
  • به ازای هر 100 میلی گرم بافت تازه، 1 میلی لیتر معرف TRIzol اضافه کنید، با استفاده از چاقوی جراحی استریل روی یخ خرد کنید و با یک pellet pestle probe همگن کنید.
  • در مورد کشت سلولی، باید بلافاصله پس از خارج کردن از انکوباتور پردازش شوند.
  • سلول‌های رشد یافته را به صورت سوسپانسیون در دور 300g به مدت 5 دقیقه در RT (15-25 درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ کنید و مایع رویی را دور بریزید یا محیط کشت را از سلول‌های رشد یافته در تک لایه جدا کنید.
  • 1 میلی لیتر معرف TRIzol به ازای هر 1 × 107 سلول به رسوب های سلولی یا مستقیماً به ظرف کشت یا فلاسک سلول های رشد یافته در تک لایه اضافه کنید. سلول های لیز شده را با نوک پیپت 1 میلی لیتری استریل و یکبار مصرف مجدد پیپیت کنید.

4- سلول یا بافت لیز شده را به یک لوله 2 میلی لیتری سیلیکونی منتقل کنید.

5- نمونه را از سوزن استریل یکبار مصرف  21 g  ده مرتبه عبور دهید. با این کار، اجزای سلولی با وزن مولکولی بالا (DNA) تکه تکه شده و حضورشان در فاز آبی به حداقل می رسد.

در ادامه

6- برای جداسازی کامل ترکیب نوکلئوپروتئینی، اجازه دهید به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق (25-15 درجه سانتیگراد) بماند.
7- اجازه دهید مخلوط به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق (25-15 درجه سانتیگراد) بماند.

8- نمونه را در 12000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتی گراد  سانتریفیوژ کنید . پس از سانتریفیوژ، نمونه را تا دمای اتاق (15 تا 25 درجه سانتیگراد) گرم کنید.

9- فاز آبی بالایی (600 میکرولیتر) را به میکروتیوب 1.5 میلی لیتری بدون RNase جدید منتقل کنید.

10- به رسوب گیری با الکل ادامه دهید.

11- از فاز آبی با مخلوط کردن با ایزوپروپیل الکل RNA را  رسوب دهید. 0.5 میلی لیتر ایزوپروپیل الکل به ازای هر 1 میلی لیتر معرف TRIZOL که برای همگن سازی اولیه استفاده می شود، استفاده کنید.
12- نمونه ها را در دمای 15 تا 30 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید و در دمای 2 تا 4 درجه سانتی گراد با دور حداکثر 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
13- مایع رویی را به طور کامل خارج کنید. رسوب RNA را یک بار با اتانول 75 درصد بشویید و حداقل 1 میلی لیتر اتانول 75 درصد به ازای هر 1 میلی لیتر معرف TRIZOL مورد استفاده برای همگن سازی اولیه اضافه کنید.
14- نمونه ها را با ورتکس مخلوط کرده و با دور حداکثر 7500 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. این مرحله را تکرار کنید.
15- رسوب RNA را در Air-dry یا خلاء خشک به مدت 5-10 دقیقه خشک کنید.
16- RNA را در آب تیمار شده با DEPC با چند بار پیپتاژ کردن، حل کنید.
17-با اسپکتروفتومتری نمونه را برای تعیین غلظت و خلوص بررسی کنید.

نتایج مورد انتظار

  • یک قطعه ژل مانند در کنار و پایین لوله RNA رسوب می کند.
  • هنگام گرفتن OD در 260 نانومتر و 280 نانومتر، نسبت A260/A280 باید بالاتر از 1.6 باشد.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.