محیط انتقال ویروس VTM

محیط انتقال ویروس VTM یک ماده مغذی است که برای حمل و حفظ قابلیت زنده ماندن نمونه ها (ویروس ها) به آزمایشگاه برای شناسایی و پردازش بیشتر نمونه استفاده می شود.

• محیط های حمل و نقل برای ویروس ها به ویژه مهم هستند زیرا نسبت به سایر عوامل عفونی حساس تر هستند.
• احتمال جداسازی موفقیت آمیز زمانی افزایش می یابد که فاصله زمانی بین جمع آوری و تلقیح کشت کمتر باشد و نمونه حاوی تا حد امکان ذرات ویروس باشد.
• به منظور به حداکثر رساندن میزان ویروس در نمونه، جمع آوری نمونه باید در اوایل بیماری بیمار انجام شود.
• جداسازی موفقیت‌آمیز و مطمئن ویروس‌ها زمانی انجام می‌شود که از یک وسیله انتقال مناسب استفاده شود.
• هنگامی که نمونه های ویروسی به یک آزمایشگاه محلی یا یک آزمایشگاه مرجع ارسال می شوند، تعداد جداسازی افزایش می یابد.

اصول VTM

• عوامل ویروسی از نظر ترکیب، پایداری، ساختار، مورفولوژی و اندازه بسیار متفاوت هستند.
• از آنجایی که این ویروس ها نسبت به شرایط محیطی حساس هستند، باید با استفاده از محلول های مختلف از قابلیت زنده ماندن این ویروس ها محافظت کرد.
• برخی از ویروس‌های پوشش‌دار، مانند ویروس‌های هرپس سیمپلکس (HSV)، هنگامی که در محیط نگهداری مناسب قرار می‌گیرند، به طرز شگفت‌آوری در حالت غیر منجمد پایدار هستند. با این حال، بیشتر ویروس ها به دمای سردتر نیاز دارند.
• عفونت‌پذیری ویروس‌ها با گذشت زمان کاهش می‌یابد و به طور کلی، میزان پوسیدگی تابعی از دما است، به طوری که با سرد کردن پایداری افزایش می‌یابد.
  بنابراین، محیط های انتقال ویروس با ایده فراهم کردن شرایط مناسب دما، pH و مواد مغذی تهیه می شوند.
• ترکیبات یک محیط انتقال ویروسی مناسب برای ایجاد یک محلول ایزوتونیک حاوی پروتئین برای محافظت از ساختار ویروسی، آنتی بیوتیک برای کنترل آلودگی میکروبی و یک یا چند بافر برای کنترل pH انتخاب می شوند.
• محیط های انتقال ویروس با ایده حفظ زنده ماندن کشت ویروسی یا نمونه ها برای آزمایش هایی مانند آزمایش تقویت اسید نوکلئیک (NAAT) و در عین حال جلوگیری از خشک شدن نمونه تهیه می شوند.

ترکیبات محیط انتقال ویروس VTM

یک محیط انتقال ویروسی ایده آل دارای بسیاری از ویژگی های زیر است:

فعالیت ویروس را حتی در دمای اتاق حفظ کند.
برای کشت سلولی غیرسمی است و ظاهر اثرات سیتوپاتیک ویروسی را پنهان نمی کند.
ماندگاری طولانی خواهد داشت (چه در حالت یخ زده یا غیر منجمد).
می تواند هم برای جداسازی های کشت و هم برای آزمایش های مستقیم مانند ایمونواسی آنزیمی یا ایمونوفلورسانس قابل استفاده باشد.
به منظور دستیابی به تمام ویژگی های ذکر شده در بالا، محیط های انتقال ویروس معمولا دارای یک جزء پروتئینی محافظ، عوامل ضد میکروبی برای جلوگیری از احتمال آلودگی و بافرهایی برای حفظ pH محلول هستند.
برخی از VTM ها همچنین دارای یون ها و مواد معدنی اضافی هستند که به حفظ حیات چنین نمونه هایی کمک می کند.

تهیه محیط انتقال ویروس VTM

تعدادی از محیط های انتقال ویروسی به صورت تجاری در دسترس هستند که می توان آنها را مستقیماً با شرایط ذکر شده خریداری و استفاده کرد.
برخی از این رسانه ها عبارتند از COPAN Universal Transport Media و Eagle Minimum Essential Media (E-MEM).
با این حال، برخی از محیط های دیگر را می توان با حفظ شرایط و ترکیب مناسب به صورت محلی تهیه کرد.
ترکیب و آماده سازی محیط انتقال ویروس VTM مختلف بسته به اینکه نمونه از انسان یا سایر حیوانات گرفته شده باشد متفاوت است.

برای نمونه از انسان

روش زیر روش آماده سازی VTM های محلی ساخته شده برای سواب بینی و گلو از انسان است:

1. 10 گرم محیط veal infusion و 2 گرم آلبومین گاوی fraction V را به آب مقطر استریل (به 400 میلی لیتر) اضافه کنید.
2. 0.8 میلی لیتر محلول سولفات جنتامایسین (50 میلی گرم در میلی لیتر) و 3.2 میلی لیتر آمفوتریسین B (250 میکروگرم در میلی لیتر) اضافه کنید.
3. با فیلتراسیون استریل کنید.

در زیر روش دقیق تری برای تهیه حجم بیشتری از VTMs برای انسان آورده شده است:

• 500 میلی لیتر سرم جنین گاوی (FBS) را با حرارت دادن به مدت 30 دقیقه در حمام آب در دمای 56.0 درجه سانتیگراد +/- 1.0 درجه سانتیگراد غیرفعال کنید. در صورت وجود از FBS غیرفعال تجاری استفاده کنید.
• 50 میلی لیتر آمفوتریسین B اضافه کنید، 50 میلی لیتر جنتامایسین را به FBS غیرفعال اضافه کنید و سپس محلول را از طریق یک واحد فیلتر 0.20 تا 0.45 میکرومتر (واحد فیلتر 150 میلی لیتر) استریل کنید.
• 10 میلی لیتر از FBS را به 500 میلی لیتر محلول نمک متعادل هنکس (HBSS) اضافه کنید.
• 2 میلی لیتر از مخلوط جنتامایسین/آمفوتریسین B را به HBSS تشکیل شده قبلی با FBS اضافه کنید.
• محلول ها را در بطری ها پخش کنید. با برعکس کردن بطری مخلوط کنید.
• روی بطری را به همراه تاریخ تولید، مواد افزودنی و تاریخ انقضا برچسب بزنید.
• 3 میلی‌لیتر از محیط را در لوله‌های مخروطی استریل جداگانه (مانند لوله‌های 100×16 میلی‌متر) به مقدار کافی تقسیم کنید. پس از توزیع مواد، درب ها را محکم بسته نگه دارید. ظروف را با اطلاعات لازم برچسب بزنید.
• در دمای 8-2 درجه سانتی گراد نگهداری شود.

برای نمونه از حیوانات

برای جمع آوری و حمل و نقل نمونه ها در حیوانات می توان از دو نوع VTM استفاده کرد.

1. محیط انتقال 199 به طور گسترده برای جمع آوری و انتقال نمونه های بالینی از همه گونه ها استفاده می شود.
2. محیط دوم، محیط انتقال PBS-Glycerol، که محیط مبتنی بر گلیسرول است، پایداری طولانی‌مدت نمونه‌ها را در جایی که خنک‌سازی فورا امکان‌پذیر نیست، فراهم می‌کند.

یک محیط انتقال ویروس مناسب به شرح زیر تهیه می شود:

1. 10گرم محیط veal infusion broth را با 2 گرم bovine albumin fraction V همراه با آب مقطر به حجم 400 میلی لیتر برسانید.
2. 0.8 میلی لیتر محلول جنتامایسین سولفات با غلظت 50 میلی گرم در میلی لیتر و 3.2 میلی لیتر آمفوتریپسین B با غلظت 250 میکروگرم در میلی لیتر به محلول بالایی اضافه میکنیم.
3. در مرحله آخر بوسیله فیلتراسیون محلول را استریل می کنیم.

آماده سازی محیط انتقال 199

یک محیط کشت بافت 199، حاوی 0.5٪ آلبومین سرم گاوی (BSA) را بردارید.
به 1 لیتر از موارد فوق اضافه کنید:

• بنزیل پنی سیلین (2×10⁶ IU/litre)
• استرپتومایسین (200 میلی گرم در لیتر)
• پلی میکسین بی (2×10⁶ IU/litre)
• جنتامایسین (250 میلی گرم در لیتر)
• نیستاتین (0.5×10⁶ IU/litre) در لیتر)
• افلوکساسین هیدروکلراید (60 میلی گرم در لیتر)
• و سولفامتوکسازول (0.2 گرم در لیتر).

با فیلتراسیون استریل کنید و در حجم های 1.0-2.0 میلی لیتری در لوله های درپوش پیچی توزیع کنید.

تهیه محیط انتقال PBS-گلیسرول

با افزودن 8 گرم نمک 0.2 گرم پتاسیم کلراید، 1.44 گرم Na2HPO4، و 0.24 گرم KH2PO4، نمک بافر فسفات را آماده کنید. آب مقطر را به این مخلوط اضافه کنید تا 1 لیتر شود.
مخلوط آماده شده را اتوکلاو کرده و با نسبت 1:1 را با گلیسرول استریل مخلوط کنید تا 1 لیتر شود.
به 1 لیتر از موارد فوق اضافه کنید:

• بنزیل پنی سیلین (2×10⁶ IU/litre)
• استرپتومایسین (200 میلی گرم در لیتر)
• پلی میکسین بی (2 x 10⁶ IU/litre)
• جنتامایسین (250 میلی گرم در لیتر)
• نیستاتین (0.5×10⁶ IU/litre)
• افلوکساسین هیدروکلراید (60 میلی گرم در لیتر)
• و سولفامتوکسازول (0.2 گرم در لیتر).

1.0 تا 2.0 میلی لیتر از محیط حمل و نقل را در ویال های پلاستیکی استریل درپوش پیچی بریزید.
این ویال ها را تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتیگراد یا به مدت کوتاه 1 تا 2 روز در دمای اتاق نگهداری کنید.

موارد استفاده از VTM

1. از محیط انتقال ویروس VTM برای جمع آوری و انتقال نمونه های حاوی ویروس استفاده می شود.
2. اینها همچنین برای حفظ زنده ماندن موجودات دیگر مانند مایکوپلاسما، کلامیدیا و اورهاپلاسما استفاده می شوند.
3. VTM ها همچنین به به حداکثر رساندن تعداد ذرات ویروسی در یک نمونه کمک می کنند.
4. محیط های انتقال مایع عمدتاً برای انتقال سواب ها یا موادی که از سواب جمع آوری به محیط رها می شوند استفاده می شود.
5. جمع آوری و انتقال نمونه ها را در مناطقی که امکانات تبرید در دسترس نیست تسهیل می کند.

محدودیت های محیط انتقال ویروس

• برخی از رشد آلاینده ها ممکن است در طول دوره طولانی حمل و نقل مشاهده شود.
• پس از حمل و نقل، نمونه باید در اسرع وقت در محیط مناسب تلقیح شود. برای نتایج بهینه، فاصله زمانی بین جمع‌آوری نمونه و تلقیح بر روی محیط کشت باید به حداقل برسد.
• برخی از ویروس ها ممکن است نسبت به سایرین حساس تر باشند و VTM ها ممکن است به همان اندازه موثر باشند.
• برخی از آنتی بیوتیک ها و مواد شیمیایی مورد استفاده در VTM ها ممکن است pH محلول را تغییر دهند که بر زنده ماندن ارگانیسم تأثیر می گذارد.

دلایل استفاده از آنتی بیوتیک و ضد قارچ در VTM

آنتی بیوتیک ها اگر در دمای 4+ درجه سانتیگراد نگهداری شوند و یا در معرض چرخه های یخ زدایی و ذوب قرار گیرند، اثر خود را با گذشت زمان از دست می دهند.

آنتی بیوتیک ها یا باید در هنگام جمع آوری نمونه ها به محیط اضافه شوند یا درهنگام آماده سازی محیط اضافه شوند و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری و درصورت لزوم ذوب شوند.

اگر محیط انتقال حاوی ویروس باشد باید در دمای 70- درجه سانتیگراد یا در ازت مایع نگهداری شود. نگهداری در دمای 20- درجه زمانی کافی است که نمونه برای PCR مورد استفاده قرار گیرد.

“کیمیا زیست گستر نوین” در راستای ارتقاء تولیدات و سطح علمی کشور مبادرت به واردات و توزیع مواد شیمیایی و مصرفی آزمایشگاهی کرده است. هدف مجموعه ما تأمين مواد و تجهيزات مورد نياز در بخش هاى مختلف آزمايشگاهى، تحقيقاتى، بيمارستانى، صنعتى و … مي باشد.

مطال مفید: